医麦课堂丨如何快速获得抗新冠病毒抗体序列和抗体亲和力信息
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关于历史悠久的血清疗法
据施威扬教授介绍，至今人类医学对病毒最主要的防护方式有三种，最熟悉的方式就是疫苗，像天花、小儿麻痹症这两种人类特有的病毒，就是被全球的疫苗接种计划所消灭的。但疫苗有很大的局限性，首先疫苗只能针对已知的病毒开发，而且开发时间非常长，没有办法应对新的病毒爆发。在接种疫苗之后需要人体产生抗体，所以获得保护需要的时间很长，起不到治疗的作用。且疫苗必须达到一定的接种范围，否则对于传染性很强的病源就起不到理想的保护作用。
除了疫苗之外，另一种应对方案就是小分子药物。但小分子药物也有很大的局限性，其药物开发的难度也非常大，并且针对病毒特异性蛋白小分子药物的可选性非常少。而在短时间内几乎不可能立刻完成一种新药的开发。
既然无法使用新药，那么只能尝试老药新用是否有效。像这次吉利德的瑞德西韦就是这样一个很好的例子，但是从现在的数据看并没有传来很好的消息，所以我们可以预期老药新用在对于新病毒的爆发，实际上其有效性也是非常有限的。
血清疗法的历史实际和疫苗一样悠久，它最早由德国医学家阿白琳发现的一种现象，就是机体的保护机能。在感染了病源以后又痊愈的动物或人的血液中含有一种可以保护机体不会再次感染的物质，如果把这种物质注射到其他动物体内，那么其他动物也会获得这些保护能力。此次，在新冠肺炎康复者血浆中已检测出高效价病毒中和抗体，实验证明，能够有效杀死新冠病毒。
为什么血清和抗体疗法效果显著？
目前抗血清的来源实际上主要两种，动物和人类来源。但是由于动物中的血清会在人体中诱发很严重的排异反应，因此一般只有在非常紧急的情况下才会使用，而且小量的皮试实验也是必须的。而如果是从人中提取出来的免疫球蛋白则没有这些问题，像破伤风、狂犬病、乙肝病毒、免疫球蛋白等。这些都是从病毒感染过的病人中提取出来的血制品，或是从健康的人使用了这些病毒的疫苗来进行免疫之后捐献的血液中获得的。但是人类能够捐献的血量是非常有限的，如果需要大量生产一些人源的抗体，就需要用其他的方法来实现，其中有一种方法是人源化的大动物，通过这种方式来免疫某种动物，我们也可以得到大量的抗血清。
抗血清或者抗体同时具有治疗效果跟保护效果，也就是说它既可以治疗被感染的病人，那么普通的人也可以通过注射来防止被病毒感染，在一两个月的时间内可以获得被动性的免疫。
人或动物的免疫系统可以在一两周之内针对病毒产生出特异性的抗体。得益于生物医药领域长期以来抗体药物的研发经验，大量生产抗体的技术已经非常成熟，即使针对一个之前未知的新病毒开发抗体疗法所需要的过程也会非常迅速的。所以，在新病毒来袭的时候，血清跟抗体疗法就成了最有前景的手段之一。
实际上，在2003年抗击SARS疫情过程中，我国还有亚洲一些国家地区都开展了不同规模的抗血清治疗临床实验，在港台以及新加坡效果都非常好，只不过是由于SARS来得快，去得也快，所以就没有办法进行后续严格的临床实验，所以这种抗血清的疗法也淡淡渐渐的淡出了大众的视线。很不幸的是在17年后，一种新的病毒再次席卷了我国，这一次我们一定不能错过开发病毒抗体药物的机会。
开发新冠病毒抗体药物有哪些挑战？
现有资料表明，很多新冠肺炎患者最后死亡的原因并非简单的肺功能损伤，而是病毒诱发了细胞因子风暴，造成免疫系统过度激活攻击自身，从而导致全身性器官衰竭。康复患者捐献的血浆/血清虽然可以在感染的各个阶段控制患者内的病毒含量，但是由于每个康复患者的抗体效价跟含量都不一样，在治疗中又很难达到稳定的疗效。
因此，如果要满足抗体疗法进入临床实验的严格的要求，我们必须开发能够准确控制效价和剂量的单克隆的抗病毒抗体药物，这样才能经得住严格的临床实验测试，最后真正让病人获益。
1. 抗体的特异性 机体针对病毒刺激产生的抗血清中，只有少量的中和抗体才能起到治疗的效果，而其他的抗体很多时候会有负面的因素。
2. 大量生产抗体的潜力 跟普通抗体药物不同，如果是用于抗病毒的抗体药物，经常面对的几十万甚至几百万的受众，我们必须要有高效的细胞工程生产能力或者大动物体系，能够快速获得大量抗体。
3. 抗体开发的速度 传统抗体药物的研发耗时巨大，而面对疫情则必须在最短的时间内筛选到可以快速生产的抗体。为此，直接从患者体内提取有效的中和抗体序列，而不是从免疫动物中获得，可以大大加快开发的速度。
快速获得抗体序列和抗体亲和力信息是抗体开发的关键
传统抗体开发过程中，当有一个蛋白靶点的时候，首先需要表达抗原，然后免疫动物，制备杂交瘤，进行抗体的筛选，然后最关键还要把抗体人源化，才能进行下游的一系列抗体的效能验证和临床实验。如果我们直接从人体内提取抗体，则不需要通过这些过程直接就可以得到人的抗体，这样相当于把传统抗体开发的路径压缩了一半，但另一半仍需很长的时间。
最早的单克隆抗体技术是获得诺贝尔奖的 杂交瘤技术，它是通过B细胞和腹水瘤融合，然后筛选单个克隆分泌的抗体，最后再测序获得抗体基因的序列。最近，单B细胞筛选技术逐渐发展起来，它首先分出单个的B细胞，然后对细胞进行转化/培养，使得单个B细胞可以在体外扩增，然后针对每个B细胞克隆分泌的抗体进行筛选。但是在这两种方法中，抗体亲和力的测定跟BCR序列的测定是在不同的步骤进行的，因此非常耗时耗力。最新发明的技术—单B细胞测序技术，则能够把这两个筛选步骤整合到一起，这样的话就可以省略了大量的中间环节。
如何在单B细胞层面获得抗体的亲和力信息？
抗体是由轻链和重链组成的。单B细胞测序就是从单个细胞中特异扩增出免疫球蛋白基因轻链和重链的可变区序列信息，在得到这两段细胞特异的序列之后，我们可以通过细胞工程，在人工培养的细胞中直接表达出跟原来的B细胞中一样的抗体，从而达到生产的目标。而根据需要测的B细胞数目的多少，又可以分为低通量单B细胞测序和高通量单B细胞测序。无论是哪种通量的细胞进行单B细胞测序，都可以让我们拿到任何一个B细胞中抗体序列。但是只知道抗体的序列是没有办法知道这个抗体针对抗原的亲和力大小，所以在抗体开发中还缺一个关键的环节，就是要得到抗体的亲和力信息。
1. 确定筛选目标。明确所需要的是哪一种B细胞，抗原特异性的B细胞有两种，一种是记忆B细胞，它表面有BCR受体可以直接跟抗原结合；另一种是抗体分泌B细胞，也就是浆细胞，它自己不能够结合抗原，但可以其分泌的抗体可以。
2. 抗原抗体结合力的信息获取。针对单个B细胞的两种信息的获取，Beacon系统（Berkeley Lights）和CelliGo平台（Hifi Bio）针对浆细胞，通过物理方法分离细胞，在分开测量两种信息之后再在单细胞上进行信息对应。相反，一种更高效的方法，LIBRA-seq技术，利用10xGenomics的mRNA和细胞表面蛋白多组学测序平台，可以一次对上千个记忆B细胞进行分析，同时得每一个细胞的中BCR序列跟BCR亲和力信息。这一方法最近的成功应用是在不到1周的时间内筛选出多种HIV广谱中和抗体。
本期课程总结：
施威扬教授：面对新冠病毒疫情，利用最新的基于单细胞测序技术的抗体筛选手段，我们预期可以在短短的6周时间内，就可以从康复患者血浆中筛选出大量的人的候选综合性抗体的序列，而这样的速度足够响应任何突发的病毒感染事件，包括当下正在发生的新冠病毒感染。
在未来，针对应对任何新的高危传染病的预防和治疗。我们都需要开发出高效的中和抗体，用于确诊病人的治疗，同时也可以用于高危人群，尤其是医护工作者的保护。
除此之外，对于传染范围很大的疾病，疫苗开发也需要同步进行，为更大范围的人群保护。在这次新冠的疫情当中，我国科学家在第一时间内鉴定出了病毒，我们相信依靠众多生物工作者的努力，我们也将在最短时间内开发出新冠病毒的抗体药物，众志成城，最终彻底赢得新冠病毒的抗击战。
Q1.Bm表面的IgM的VH和激活后分泌IgG的VH是一样的吗？是否可以通过荧光标记抗原直接通过流式钓记忆B细胞？但是为什么没有被普遍接受呢？
施教授：是一样的, 记忆B细胞表面的IgM BCR通过class switch变成浆细胞中分泌的IgG，这两者的轻链重链可变区是一样的。
现在基于流式的筛选抗体方法主要就通过用荧光标记的抗原跟记忆B细胞表面的BCR特异结合。
之前没有被普遍接受的原因有几点：
1. 浆细胞里面特异针对新近抗原刺激的比例高，传统的杂交瘤都是筛选融合的浆细胞而不是记忆B细胞
2. 尽管可以通过FACS分选出抗原特异的记忆B细胞，但是分离出的单B细胞培养成功率不高，因此虽然能够有效分离，但是无法有效利用这些细胞进行后续抗体筛选等步骤。这些困境直到单B细胞测序技术成熟才真正得到解决。
Q2.利用您提到的单细胞测序和刚才了的抗原流式钓的方法，能否迅速并准确的拿到目的记忆B细胞？
施教授：是的， FACS分选的结合了荧光抗原的记忆B细胞可以快速拿到抗原阳性的B细胞，并通过单细胞测序方式得到可变区序列。但是，分选后的B细胞无发跟FACS流式信号中的反映亲和力高低的荧光信号对应起来，因此即使拿到了某个B细胞的可变区序列，仍然不知道这个BCR的亲和力信息，那么FACS单B细胞分析的速度优势就没有很好的体现出来。为了解决这个问题，LIBRA-seq增加了一个用DNA oligo标记的抗原，这样就让我们能够在单细胞测序的同时也得到相应的BCR的结合强度信息。
Q3.抗体药物开发如何应对可能的病毒变异。有人建议开发突变体ACE2-Fc融合蛋白，施教授怎么看？
施教授:关于ACE2-Fc融合蛋白的想法，应该是利用ACE2去竞争性结合病毒，然后让巨噬细胞等通过识别Fc将病毒吞噬，这样就不需要专门针对病毒的抗体了。这里有几个潜在的问题，一是ACE2本身是一个血管调节素酶，人为过表达会有潜在负面影响第二，这个融合蛋白在血液中可能在结合病毒之前就很快被自身的免疫系统清除掉。
Q4.不同新型冠状病毒感染人群，个体体内可能产生多种不同的针对病毒的抗体，有些可能是无效的，开发过程中如何筛选到特异性的抗体？
施教授: 中和抗体有一套成熟的筛选标准和流程。首先是细胞实验，会测试中和抗体能否阻止活病毒感染带有ACE2受体的细胞，例VERO细胞株。下一步是动物实验，验证抗体保护动物不被病毒感染的能力。
Q5.血浆治疗是在疾病发展的前期使用比较好，还是对重症、危重症这部分患者更有效？还有对于可能已经产生炎症因子风暴的这些患者会不会效果不大？
施教授:从清除病毒角度，抗体在哪个阶段都有效，但是在早期副作用小，可以阻止向重症发展。后期如果出现细胞因子风暴，那么给予外部抗体可能会反而会加重这一症状。不过如果用控制炎症的单抗来进行治疗的话，我认为外加一些好的中和抗体有助于尽快降低病毒载荷。
Q6.单细胞测序技术在肿瘤新抗原疗法的应用现状?肿瘤的异质性，对于筛选新生抗原来说，单细胞测序技术有什么优势？
施教授: 肿瘤新抗原通常是从肿瘤的全外显子数据中预测出来的，但是这些预测出抗原在肿瘤中有多大比例的细胞表达，是否同时表达在每一类细胞中，无法从计算中得到答案。单细胞测序可以真实看到每一类肿瘤细胞中具体表达了多少种预测的新抗原，依据这些细胞特异的新抗原信息，有助于1. 验证算法预测的抗原 2. 选择最优的抗原组合。