它是最容易造假的实验之一，为啥学界用了40年还不放弃？
图片来源：ptglab.com
编译 李光昭 魏潇
编辑 魏潇
“科研圈”报道·keyanquan·
蛋白质印迹法（Western blotting，WB）可能是分子生物学和蛋白质组学研究中应用最广泛的技术之一。如果你身边有相关专业的小伙伴，他们很可能曾向你痛诉过自己的 WB 实验血泪史。这项常被简称为“Western”或“蛋白电泳”的技术诞生于上世纪 70 年代，一直被用来分离动植物组织样品中的特定蛋白，并能够检测相应蛋白的表达水平、相对活性和化学修饰等情况。
今年，Western blotting 迎来了它的 40 岁生日，虽然它仍然坐在蛋白质研究技术的“头把交椅”上，但身后却从来没有缺少过批评与质疑。
和许多研究技术的诞生类似，WB 也有不止一位“家长”。目前大家公认 1979 年 7 月 1 斯坦福大学 George Stark 实验室发表于《美国国家科学院院刊》（PNAS）的论文是它的首次亮相。当时，这个初始版本的蛋白质印迹法还未进化为现在的常用版本：琼脂凝胶或聚丙烯酰胺胶（PAGE）被作为电泳载体将样品中不同大小的蛋白质分离开；随后，效率不那么高的毛细管虹吸印迹法被用来将蛋白转印到重氮苄基羟甲基（diazobenzyloxymethyl）滤纸上；最后同位素 125-I 标记的蛋白 A 作为检测抗体，来识别目标蛋白。
或许同一领域中，开拓者的想法总会出现巧合。两个月后，来自瑞士弗雷德里克·米歇尔研究所（Friedrich Miescher Institute）的 Harry Towbin 和同事们也在 PNAS 上发表了蛋白质印迹技术的论文。不同的是，Towbin 在用于分离蛋白质的 PAGE 凝胶中加入了十二烷基硫酸钠（SDS,一种强还原性的表面活性剂）或尿素，创造了SDS-PAGE 和 Urea-PAGE；在转印中采用硝酸纤维素膜（NC 膜）为固定相，并且创立了转印后先使用第一抗体识别蛋白、再使用第二抗体进行信号检测的新系统。Towbin 实验室的这篇论文虽然不是蛋白印迹法的首次亮相，但是其中的许多方法一直沿用至今，与目前实验室中的 Western blotting 基本一致——很多实验室的转膜缓冲液（Towbin buffer）配方甚至都和 40 年前的一模一样。
故事到这里还没有结束，来自弗雷德·哈钦森癌症研究中心（Fred Hutchinson Cancer Research Center）的 W. Neal Burnette 几乎与前两个实验室同时完成了这项技术的论文手稿，但是他的发表之路却没那么顺利——《分析生物化学》（Analytical Biochemistry）一开始拒掉了他的投稿，直到两年后的春天才回心转意发表了这篇论文。由于 Burnette 的实验室和发明者之一的 Stark 实验室都位于美国西海岸，因此 Burnette 团队沿用了 DNA 杂交印迹法（Southern blotting）和 RNA 杂交印迹法（Northern blotting）的命名传统，在论文的标题中将这项技术称为 Western blotting。至此，这项分子生物学实验的“标配”才走完了它的诞生之路。
三个团队中，Towbin 的技术方法最受欢迎——时至今日也依然是 WB 实验的主流。因此尽管 Stark 实验室的论文在发表时间上拔得头筹，但 Towbin 的论文却是三篇文章中引用数最高的，目前已经达到了五万八千多次。
蛋白质印迹法流程图。图片来源：Western blotting: A guide to current methods
在面世的前 15 年，WB 发展成了一项重要的检测手段。1986 年，《新英格兰医学杂志》（New England Journal of Medicine，NEJM）的一篇论文使用该技术在人类大脑组织中检测到了克雅氏病（Creutzfeldt-Jakob）的标记蛋白，为疾病诊断提供了有力的方法。从免疫组学到神经科学再到新药开发，WB 在科学领域应用广泛，并做出了众多贡献。根据法国生物学家 Christian P. Moritz 的统计，PubMed 数据库 1989 年发表的蛋白质研究中，光是将 WB 放在标题中的论文就有 156 篇，作为当时新兴技术的 WB 如同现在的基因编辑技术，成为了学界的宠儿。
然而，这种风光并未能延续至今。二十世纪 90 年代以来，WB 对蛋白质半定量分析的准确性和可重复性开始遭受学界质疑，更糟糕的是它不断被卷入学术造假的丑闻和风波中。伴随它出现的几乎总是“学术不端”和“职业终结”之类的坏消息。
在著名的学术打假平台“撤稿观察”（Retraction Watch） 网站上，光是用“Western blot” 这个关键词就能搜出 200 多篇文章和报道（不排除对同一件事的重复报道）。全职数据侦探、曹雪涛问题论文曝光者 Elisabeth Bik 曾和她的团队扫描了 1995 - 2014 年间发表的 2 万多篇涉及 WB 的学术论文，发现近 4%（782 篇）的论文都存在至少一张数据图的不恰当复制和使用。虽然调查没有明确这些问题数据是否都是 WB 图片，但 Bik 认为其中大约有一半都是。
由于 WB 操作繁琐、环节众多，因此实验者无意中犯错的概率也随之增加，这极大地影响了其准确性和重复性。而一些关键步骤，如样本准备方式、免疫反应中一抗和二抗的抗体质量和浓度、条带定量的分析方法，都对最终结果有着至关重要的影响。所以做出漂亮的 WB 结果并不那么容易。
每个做 WB 的人的噩梦——白板。图片来源：丁香园论坛上的网友
最常见的场景是，每个实验室都有一套“专属秘方”。当研究生们在一起讨论封闭浓度和时间，转膜时间和具体的电泳电压参数的时候，仿佛大家做得都不是同一个“Western”。很多经验丰富的实验室老手都会感叹 WB 是技术，更是一门艺术——对于提倡数据准确性和结论可重复性的现代西方科学来说，我们很难判断这究竟是夸奖还是讽刺。
尽管学术界对 WB 有各种负面的评价，却无法否认，WB 是一项检测特定蛋白质的有效方法。种种数据表明，WB 技术虽然稳定发挥，但已经不在聚光灯下。
2018 年，PubMed 中共有 194,262 篇蛋白相关的论文，其中有16,196（8.3%）篇用到了 WB。时间跨度更广的统计结果也显示，尽管面临种种非议，WB 的使用比例在过去 30 年中稳定在 8% 到 9% 左右。而且这一比例很有可能被低估：不少论文应用了该技术，却没有文字性地写明，这类可能未能被统计入内。而更为现代和准确的蛋白质谱技术（MS），在过去十年中应用比例则稳定在 4%，仅仅是 WB 的一半。同时，相比于其他定量或半定量的蛋白质分析技术，如占比 3% 的 ELISA（酶联免疫吸附法），4% - 6% 的 IHC（免疫组化）和 4% - 5.5% 的显微成像技术，WB依旧没有丢掉应用率最高的宝座。
这或许得益于它的经济性和简易性。不过上世纪 80 年代曾被数百篇论文放在标题上的辉煌确实已经一去不回：1989 年是 WB 的顶峰，蛋白相关的论文题目中的提及比例达 34‰，而在近十年只有不到 0.5‰。相对的，质谱技术在近十年稳定在 5‰-6‰，远高于其他蛋白检测手段 0.5–2‰ 的数字。
图为 Western blotting 在文章中和题目中的出现率，与其他检测手段对比数据。图片来源：40 years Western blotting: A scientific birthday toast
显然，40 岁的 WB 并没有过时——毕竟它的应用度在近十年中比其他蛋白鉴定与定量技术高出一倍之多。虽然 WB 的原理依旧，但这项技术已经有了多处改善，实现了更高效，更节省样本量和更好的重复性。
WB 在高端学术杂志的表现可能预示了它的发展方向。目前研究者们已经就 WB 的效率和小型化趋势有所行动，比如以毛细管电泳或等电聚焦电泳代替传统 PAGE 胶。值得一提的是，在改善后的方法中，更接近了“印迹法”的实际意义——蛋白质可以不被转移，直接固定在毛细管中。此外，研究者们还在尝试改良用某个特定蛋白做内部参照物的传统定量方法，开始向总蛋白染色的方式转变，希望以此加强该技术在免疫诊断领域的应用发展。
各种仪器设备的开发和提高也大幅度改善了 WB 的效率和准确性。总的来说，WB 的未来不仅取决于其技术流程上的改进，更要依靠于研究人员的专业性、科学家们（的态度），以及抗体公司的质量。
对于一名学者来说，在学术界工作 40 年可能意味一份即将到手的 “终生荣誉”，或者带着曾经的非议走默默走向职业生涯的尾声。而令人又爱又恨的 Western blotting ，仍将会带着荣誉和非议继续活跃在所有需要它的实验室里。
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参考资料：
1. Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28974114
2. Western blotting: A guide to current methods.
https://www.sciencemag.org/collections/western-blotting-guide-current-methods
3. 40 years Western blotting: A scientific birthday toast.
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1874391919303471
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