这是《肠道产业》第 424 篇文章
编者按：
随着人们对微生物组的认知不断深入，益生菌的相关研究也在不断增长。人们开始更加重视益生菌的循证工作，益生菌临床试验数量不断增加。
那么在益生菌临床试验中，哪些菌株是被研究最多的？哪些国家是开展研究最多的？又存在着什么问题？
今天，我们特别编译题为“Global analysis of clinical trials with probiotics ”的文章。希望该文能够为相关的产业人士和诸位读者带来一些启发和帮助。
要点
●在 Clinicaltrials.gov 和/或世界卫生组织国际临床试验注册平台（ICTRP）注册的 1,000 多项益生菌临床研究，涉及 700 多种不同的疾病和症状；
●益生菌临床试验的平均规模（74 名参与者）与 ClintTrials.gov 上所有研究的总体平均水平相当；
●鼠李糖乳杆菌 GG（Lactobacillus rhamnosus GG）和动物双歧杆菌 BB12（Bifidobacterium animalis ssp. lactis BB12）是研究最多的益生菌菌株；
●部分产品的成分表上不会注明所使用的益生菌的确切成分和剂量；
●在 Clinicaltrials.gov 网站上进行的益生菌研究大多在美国或欧洲注册（56%），ICTRP 的数据显示，益生菌的临床研究在亚洲增长迅速，特别是在伊朗和中国。
益生菌的定义是：活的微生物，并且当摄入足够数量时，会给（人类）宿主带来健康益处（FAO/WHO, 2002）。在 2014 年，一个专家小组确认了 2002 年的“益生菌”定义并对说法进行了些许改动（Hill et al., 2014）。除了拥有基本特征以外，如果要将一种微生物指定为益生菌，那么必须在临床上确立其益生作用，这意味着需要在相关目标人群中进行具有合理设计和规模的临床研究，并公布结果（Gibson et al., 2011; EFSA NDA Panel, 2016）。在临床研究领域内，文章发表的偏向性长期以来备受关注，有积极结果的干预研究被发表，而无效和阴性的研究难以被发表（Johnson and Dickersin, 2007; Brassington, 2017）。如果能够公开无效和阴性的研究结果信息，特别是在可能观察到意外的副作用或次生效应的情况中，则可以为研究者提供多种见解。为解决这个问题，科研界建立了登记机构，在临床试验开始前可在此类机构进行登记公开。此后，1997 年美国国会颁布了《食品和药物管理局现代化法》，要求美国国立卫生研究院（NIH）运作一个采集临床试验的公共信息源。2000 年 2 月，NIH 下属的美国国家医学图书馆通过互联网向公众开放临床试验网站。此外，不同组织国家还建立了许多其他临床试验注册中心。而世界卫生组织（WHO）努力将所有注册中心整合到同一个平台——国际临床试验注册平台（ICTRP）。不仅如此，自 2005 年起，国际医学杂志编辑委员会决定，只有进行登记注册的临床试验才被允许发表（de Angelis et al.，2004）。2008 年修订的《赫尔辛基宣言》提出，“在招募第一个受试者之前，每个临床试验都必须在一个公开的数据库中注册”（World Medical Association, 2008）。虽然注册中心的建立主要是为了记录计划中的药物、诊断、设备和治疗方案的试验，但多年来，包括益生菌在内的饮食干预研究也越来越多地开始进行注册。这解决了益生菌临床试验具有异质性、偏颇性和低质量研究结果的批评，以及发表劣质临床试验报告的问题（Suez et al.，2019）。本研究的目的是调查有哪些使用益生菌的临床研究已经注册，在哪里注册，以及从在线注册中得出这些研究的设计、特点和质量是否与 Clinicaltrials.gov 中的整体注册情况相当。此外，本研究还对调查的疾病和条件进行了分析，并对 2 个主要数据库（Clinicaltrials.gov 和 ICTRP）之间登记的益生菌试验进行了地域比较。
截至 2019 年 8 月 1 日，使用搜索词 “益生菌（probiotics）”进行检索的结果显示，Clinicaltrials.gov 数据库包含 1341 项相关研究。作为比较，我们同时使用了“微生物群（microbiota） ”和“益生元（prebiotics） ”进行检索，前者产生了 2151 项研究，后者产生了 342 项研究（图 1）。在 Clinicaltrials.gov 中注册的益生菌临床研究的注册量一直很稳定，自 2010 年以来每年都有 100 项左右的研究，最近几年数量有增加的趋势。由于益生菌种类繁多，因此不仅要在菌种层面上确定所使用的益生菌，而且要确定所使用的具体菌株。在 852 项可分析的研究中，有 321 项研究（38%）使用的是单一菌株或 2 种菌株的组合，但是也有 89 项研究（10%）使用了 3 个或更多菌株的制剂。在菌株水平上，鼠李糖乳杆菌 GG（Lactobacillus rhamnosus GG） （Gorbach, 1996; Goldin et al., 1996） 是最常使用的益生菌菌株，共有 146 项研究涉及，其次是动物双歧杆菌 BB12（Bifidobacterium animalis ssp. lactis BB12 ）（Jungersen et al., 2014），共有 55 项研究涉及。在多菌株制剂方面，由 3 种双歧杆菌、4 种乳酸菌和 1 种嗜热链球菌菌株组成的混合物 VSL#3（Mora et al., 2019）是总共 74 项研究中使用最多的多菌种制剂。在不少临床研究中，对使用的益生菌制剂的描述并不完整。甚至具体的细菌种类和菌株，以及使用的剂量，都不一定有清楚的说明。只有 49%的研究给出了完整的菌种鉴定。益生菌的定义指出它们的使用量要达到一定量时才能发挥作用（WHO/FAO Working Group report 2002, Hill et al., 2014）。通常有效的剂量范围是每天 107~9×1011 CFU（菌落形成单位）。但是在一些研究中，却没有按照推荐的方法以 CFU 为单位报告剂量，而是以克数、滴数为单位，或者根本没有说明。只有 42%的研究中，正确地按照 CFU 为单位说明了使用剂量。表1.在 ClinicalTrials.gov 注册的益生菌临床研究特点与 Clinicaltrials.gov 中收录的所有 NCT 研究（NCT 是 ClinicalTrials.gov 上进行注册的研究的识别代码）相比，使用益生菌的研究更多集中在儿童身上，而对 >65 岁的老人则较少（表 1）。Clinicaltrials.gov 中注册的大多数研究都是以患者为对象。然而 583 项使用益生菌的研究（占总数的 43%）也包括健康参与者。这一比例高于所有注册临床试验中接受健康志愿者的平均 25%（表 1）。其中一个原因可能是，监管当局（如欧洲食品安全局 EFSA）要求的益生菌健康声明申请需要健康个体研究的支持（EFSA NDA panel, 2016）。在这种情况下，了解哪些部分的益生菌临床试验是由工业界赞助的就变得有趣和有用了，幸运的是 Clinicaltrials.gov 数据库允许按资助类型过滤研究。对于益生菌的研究，33.6%是由工业界资助的，这与所有临床试验中由工业界资助的 33.1%并无显著差异（P>0.05，Chi-square），但低于生物制剂的临床试验（42%由工业界资助）。临床益生菌研究的参与者数量（从 1 人到 500 人）以及研究的持续时间（从 30 天到 10 年以上）都存在较大差异。虽然我们有理由认为，参与者较多的研究需要更长的时间来招募，因此总的持续时间较长，但是参与者数量和益生菌的研究持续时间之间没有显著的关联（R2 = 0.025；p> 0.05）。Clinicaltrials.gov 允许在注册试验时添加研究文件。这些文件可包括研究方案、统计分析计划以及知情同意书，有助于评估研究的质量。遗憾的是，在所有登记的益生菌试验中，只有 2%的试验增加了研究方案和统计分析计划。研究方案和统计分析计划的摘录可以在注册中找到，但这些信息的详细程度差异很大。在所有注册的益生菌研究中，有 0.5%（n = 4）的研究包含知情同意书。值得注意的是，益生菌研究的这一数值与在 Clinicaltrials.gov 注册的所有研究的结果并无差别。与所有临床研究一样，益生菌的临床研究结果经常被 Cochrane 图书馆（https://www-cochranelibrary-com）等机构用来进行荟萃分析。Cochrane 图书馆目前（2019 年 8 月）收录了 50 篇标题、摘要或关键词中含有匹配词语的关于益生菌的综述。2015 年，发表了一篇关于慢性溃疡性结肠炎回肠袋肛门吻合术后的治疗和预防的综述 （Singh et al., 2015），这篇论文的结论是，“低质量的证据表明 VSL#3（由 11 个不同菌株组成的联合体，每天服用 6×1011CFU）可能比安慰剂更有效”。作者指出：“需要精心设计、充分有力的研究来确定治疗和预防囊炎的最佳疗法。”令人鼓舞的是，自 Cochrane 这篇文章发布以来，已经有 7 项新的研究开始使用 VSL#3、其它益生菌或其它形式的微生物制剂来解决这个问题。这是一个保守的估计，因为更多的研究可能尚未登记或已在其他数据库中登记。含有益生菌的临床研究，平均参与人数与整体临床研究的平均参与人数没有差别。在胃肠道疾病和消化系统疾病方面，登记了 128 项使用益生菌的研究，平均参与人数为 74 人。这与登记册记录的所有临床研究的平均参与人数 71 人相当。多年来，使用益生菌的研究的平均参与者人数没有变化（根据 2000 年至 2017 年的趋势分析）。Clinicaltrials.gov 列出了研究的注册日期，以及纳入第一个参与者的日期和研究的结束日期。仔细分析益生菌的临床研究，发现只有 32%的研究是在第一批参与者被纳入之前注册的。大多数研究是在研究结束前登记的，甚至有些研究在研究完成后 900 天才进行登记。这不符合 Good Clinical Practice，因为主要和次要结果参数应在研究实际开始前预先确定（并登记），而不是事后才登记。在 Clinicaltrials.gov 登记的益生菌的研究涉及 713 种不同的疾病。在已完成的研究中，最常研究的疾病是消化系统疾病（253 项研究）和胃肠道疾病（253 项研究）。在前 10 项研究的病症中，有 7 项是胃肠道疾病和病症。对于最新的益生菌研究（被列为注册但尚未招募），可以注意到向非胃肠道疾病的转变。在 86 项正在进行但尚未招募的研究中，涉及 198 种病症。前 3 个病症分别是传染性疾病（15 项研究）、感染（15 项）和代谢性疾病（12 项）。这表明益生菌的重点可能开始逐渐转向代谢综合征。表 2.在国际数据库进行注册的益生菌试验：表中数据反映了 2017 年 12 月和 2019 年 3 月在国际临床试验注册平台（ICTR）和 Clinicaltrials.gov（CTG）中以 “益生菌”为关键词识别的临床试验数量。中国临床试验注册中心（ChiCTR）、荷兰国家试验注册中心（NTR）、德国临床试验注册中心（DRKS）、日本初级注册中心网络（JPRN）、韩国临床研究信息服务（CRiS）、伊朗临床试验注册中心（IRCT）、巴西临床试验注册中心（ReBec）、古巴临床试验公共注册中心（RPCEC）、澳大利亚新西兰临床试验注册中心（ANZCTR）。NCT 是在 Clinicaltrials.gov 注册的研究的识别代码。Clinicaltrials.gov 数据库由美国国家医学图书馆设计和运营，是 NIH 的一部分。它包含美国以及 208 个其他国家的 313,704 项临床研究的数据（2019 年 8 月评估）。在所有注册的临床研究中，有 123,860 项（39%）在美国注册。但是在益生菌的研究中，美国（18%）并不具有这样的优势地位，在 Clinicaltrials.gov 上注册的大多数（38%）关于益生菌的研究发生在欧洲。世界卫生组织也建立了一个基于网络的临床试验登记平台：ICTRP（世界卫生组织；https://www.who.int/ictrp/en/）。该平台整合了中国、古巴、德国、印度伊朗、日本、韩国、荷兰、秘鲁、斯里兰卡和泰国等国家注册平台，以及欧盟和泛非注册平台和 Clinicaltrials.gov。2017 年 12 月，ICTRP 收录了 625 项益生菌临床研究的数据。在这 625 项研究中，有 347 项还具有 Clinicaltrials.gov（即 NCT）编号。其他益生菌的试验则仅在 ICTRP 注册，这些试验主要来源于伊朗、日本、澳大利亚和新西兰以及中国。来自 ICTRP 的益生菌试验的地理位置与 Clinicaltrials.gov 比较见表 2。从这些数据可以得出结论，ICTRP 注册的试验数量增长速度快于 Clinicaltrials.gov，中国和伊朗是益生菌临床研究增长最多的国家。如上所述，除了 1,341 项关于益生菌的研究外，Clinicaltrials.gov 还列出了 2,151 项关于微生物组的研究。微生物组是十年前开始流行的术语，用于描述栖息在特定生态系统中的微生物集体，如人类胃肠道。临床研究中使用这个搜索词的数量显示自 2010 年以来大幅增加，超过的数量自 2013 年以来研究益生菌。对研究临床条件与肠道菌群组成（变化）之间关系的兴趣，可能是发现具有益生菌特性的新细菌物种的主要途径。目前，24%的研究是观察性的，这并不奇怪。然而肠道菌群（包括组成和功能）对人体免疫系统功能的重要性已经在癌症检查点抑制疗法的研究中得到体现（Rijkers et al.，2019）。此外，益生菌，特别是洛德乳杆菌（Lactobacillus reuteri），可以通过抑制固有淋巴样细胞，减少免疫检查点疗法的负面作用——结肠炎的发生（Wang et al.，2019）。粪菌移植和益生菌的计划，以及招募中和正在进行的临床试验的结果，都将有望使癌症的检查点抑制免疫疗法获得更高的成功率。同时也可能发现益生菌在调节免疫系统方面的功能，产生预防和治疗疾病方面的新应用。在 Clinicaltrials.gov 上搜索“益生菌”最终收集到 1,341 项研究，搜索 ICTRP 数据库得到 278 项研究，总计 1,619 项。虽然益生菌研究的注册还可以进一步改进，但在规模、儿童和老年人的纳入以及在科学文献中发表方面，它们似乎与一般注册的研究已经没有太大区别。鼠李糖乳杆菌 GG （Lactobacillus rhamnosus LGG）和动物双歧杆菌 BB12（Bifidobacterium animalis ssp. lactis BB12）是研究最多的益生菌菌株。在 Clinicaltrials.gov 网站上进行的益生菌研究大多在美国或欧洲注册（56%）。ICTRP 的数据显示，益生菌的临床研究在亚洲迅速扩大，特别是在伊朗和中国。目前对肠道菌群（包括粪便菌群移植）的研究可以发现具有益生菌特性的新菌株。正在进行和计划中的研究不仅限于胃肠道疾病，而且还针对神经系统和神经退行性疾病以及自身免疫性疾病。（滑动下方文字查看）
1.de Angelis, C., Drazen, J.M., Frizelle, F.A., Haug, C., Hoey, J., Horton, R., Kotzin, S., Laine, C., Marusic, A., Overbeke, A.J., Schroeder, T.V., Sox, H.C., Van Der Weyden, M.B., 2004. Clinical trial registration: a statement from the international committee of medical journal editors. N. Engl. J. Med. 351, 1250–1251.2.Brassington, I., 2017. The ethics of reporting all the results of clinical trials. Br. Med. Bull. 121 (1), 19–29.3.EFSA NDA Panel (EFSA Panel on Dietetic Products, Nutrition and Allergies), 2016. Guidance on the scientific requirements for health claims related to the immune system, the gastrointestinal tract and defence against pathogenic microorganisms, 2016 EFSA J. 14 (1), 4369, 23.4.FAO/WHO, 2002. Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food.https://www.who .int/foodsafety/fs_management/en/probiotic_guidelines.pdf.5.Gibson, G.R., Brummer, R.J., Isolauri, E., Lochs, H., Morelli, L., Ockhuizen, T., Rowland, I.R., Schrezenmeir, J., Stanton, C., Verbeke, K., 2011. The design of probiotic studies to substantiate health claims. Gut Microb. 2 (5), 299–305.6.Goldin, B.R., Gualtieri, L.J., Moore, R.P., 1996. The effect of Lactobacillus GG on the initiation and promotion of DMH-induced intestinal tumors in the rat. Nutr. Canc. 25, 197–204. Gorbach, S.L., 1996. The discovery of Lactobacillus GG. Nutr. Today 31, 2S–5S.7.Hill, C., Guarner, F., Reid, G., Gibson, G.R., Merenstein, D.J., Pot, B., Morelli, L., Canani, R.B., Flint, H.J., Salminen, S., Calder, P.C., Sanders, M.E., 2014. The International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics consensus statement on the scope and appropriate use of the term probiotics. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 11, 506–514.8.Johnson, R.T., Dickersin, K., 2007 Nov. Publication bias against negative results from clinical trials: three of the seven deadly sins. Nat. Clin. Pract. Neurol. 3 (11), 590–591.9.Jungersen, M., Wind, A., Johansen, E., Christensen, J.E., Stuer-Lauridsen, B., Eskesen, D., 2014. The science behind the probiotic strain Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12(®). Microorganisms 2 (2), 92–110.10.Mora, D., Filardi, R., Arioli, S., Boeren, S., Aalvink, S., de Vos, W.M., 2019. Development of omics-based protocols for the microbiological characterization of multi-strain formulations marketed as probiotics: the case of VSL#3. Microb. Biotechnol.11.Public Law, 1997. 105–115: Food and Drug Administration Modernization Act of 1997. Adopted November 21, 1997. https://www.gpo.gov/fdsys/pkg/PLAW-105publ115/ pdf/PLAW-105publ115.pdf. (Accessed August 2019).12.Rijkers, G., Andriessen, Q., van Overveld, F.J., 2019. Death and the Miser: microbiota regulate the outcome of checkpoint inhibition immunotherapy. Expet Rev. Anticancer Ther.13.Singh, S., Stroud, A.M., Holubar, S.D., Sandborn, W.J., Pardi, D.S., 2015. Treatment and prevention of pouchitis after ileal pouch-anal anastomosis for chronic ulcerative colitis. Cochrane Database Syst. Rev. (11), CD00117614.Suez, J., Zmora, N., Segal, E., Elinav, E., 2019 May. The pros, cons, and many unknowns of probiotics. Nat. Med. 25 (5), 716–729.15.Wang, T., Zheng, N., Luo, Q., Jiang, L., He, B., Yuan, X., Shen, L., 2019. Probiotics Lactobacillus reuteri abrogates immune checkpoint blockade-associated colitis by inhibiting group 3 innate lymphoid cells. Front. Immunol. 10, 1235.16.World Health Organisation. International clinical trials registry platform. "https://www. who.int/ictrp/about/en/Accessed August 2019.17.World Medical Association, 2008. Declaration of Helsinki. Ethical Principles for Medical Research Involving Human Subject . 59nd WMA General Assembly. Seoul, Korea. htt ps://www.wma.net/what-we-do/medical-ethics/declaration-of-helsinki/doh-oct 2008/. (Accessed August 2019).
原文链接：Dronkers T M G, Ouwehand A C, Rijkers G T. Global analysis of clinical trials with probiotics[J]. Heliyon, 2020, 6(7): e04467.作者｜Dronkers T M G，Ouwehand A C，Rijkers G T