空间转录组|Space Ranger的使用
10x Genomics在分析软件这一块还是非常给力的，开发的每个软件都非常好用而且操作简单，特别是安装方便，基本解压后就能用。对于10x的空间转录组数据主要用10x自己开发的Space Ranger来进行前期的处理。
软件下载地址：
https://support.10xgenomics.com/spatial-gene-expression/software/downloads/latest
可以直接点击下载，也可以用下面的curl或wget命令下载。
基因组下载：
在前面同一个页面往下拉就能看到。
10x提供了专门的用于空间转录组分析的基因组，目前最新的基因组版本是2020年6月更新的，基因注释为Ensembl 98版本，主要包括人和小鼠。
系统要求
Linux系统上运行最低要求：
8核Intel或AMD处理器（建议使用32核）
64GB RAM（建议128GB）
1TB可用磁盘空间
64位CentOS / RedHat 6.0或Ubuntu 12.04
集群模式下运行需要额外满足以下要求：
每个节点 8核Intel或AMD处理器
每个内核 6GB RAM
共享文件系统（例如NFS）
SGE或LSF批处理系统
软件安装
第一步，解压SpaceRanger文件
1 tar -xzvf spaceranger-1.1.0.tar.gz
第二步，解压参考基因组文件
1 tar -xzvf refdata-gex-GRCh38-2020-A.tar.gz
第三步，加入环境变量
1 export PATH=/opt/spaceranger-1.1.0:$PATH
输入文件准备
fastq序列文件：
10x建议测序read2设置90个碱基的长度。从下面10x测试的6个样本来看，reads序列长度达到70bp以后，mapping率就不太变化了，有些样本在长度大于90bp以后mapping率反而下降了。10x给出这样的建议是考虑到建库后插入片段太短的话，太长的序列里面会包含部分polyA甚至UMI序列反而影响比对效果。因为国内目前基本上是测2x150bp的，如果建库片段过短比对率较低的话建议将read2剪切成90bp来分析效果应该会好一点。
Fastq文件名建议是如下格式的，以免运行报错。
图像文件：
Space Ranger支持两种样式的显微镜图像：用苏木精和曙红（H＆E）染色的明场图像，必须是24位彩色TIFF，16位灰度TIFF或JPEG。Space Ranger要求任一方向上的图像至少为2000像素。
注意：图像边框的四个角位置是固定的，比如说三角形在左下角，如果扫描出来的图片四个角的位置变了需要先手动调整过来再使用。
软件运行
一般我们拿到的都是直接是fastq序列文件了，所以可以直接跑spaceranger count，不需要再去运行spaceranger mkfastq了。
spaceranger count运行时图片对其有两种方式，一种软件自动识别图片进行对齐，另外一种就是先用Loupe软件手动对齐，生成对于json文件提供给后面的软件，后期会介绍怎么来手动调整图片。
自动对齐
1 $ cd /home/jdoe/runs
2 $ spaceranger count --id=sample345 \
3 --transcriptome=/opt/refdata/GRCh38-3.0.0 \
4 --fastqs=/home/jdoe/runs/HAWT7ADXX/outs/fastq_path \
5 --sample=mysample \
6 --image=/home/jdoe/runs/images/sample345.tif \ 7
7 --slide=V19J01-123 \
8 --area=A1
手动对齐
1 $ cd /home/jdoe/runs
2 $ spaceranger count --id=sample345 \
3 --transcriptome=/opt/refdata/GRCh38-3.0.0 \
4 --fastqs=/home/jdoe/runs/HAWT7ADXX/outs/fastq_path \
5 --sample=mysample \
6 --image=/home/jdoe/runs/images/sample345.tif \
7 --slide=V19J01-123 \
8 --area=A1 \
9 --loupe-alignment=sample345.json
参数说明：
--Id：结果输出文件夹名称
--Transcriptome：基因组目录
--Fastqs：fastq文件木兰路
--Sample：原始样本名
--Image：镜像图片文件
--Slide：使用的10x芯片型号
--area：样本所在芯片的区域（四通道芯片位置从上到下分别为A1、B1、C1、D1）
--loupe-alignmen:图片手动对齐生成的json文件，如果是自动对齐不要需要此参数
另外，spaceranger默认使用系统上可用的所有内核来执行管。可以使用--localcores选项来限制使用内核的数量。同理，可以使用-localmem来限制使用内存的大小。
结果输出：
成功运行后会到的下面的信息（包括主要的输出文件）
1 2016-11-10 16:10:09 [runtime] (join_complete) ID.sample345.SPATIAL_RNA_COUNTER_CS.SPATIAL_RNA_COUNTER_CS.SUMMARIZE_REPORTS 2
2
3 Outputs:
4 - Run summary HTML: /opt/sample345/outs/web_summary.html
5 - Outputs of spatial pipeline: /opt/sample345/outs/spatial
6 - Run summary CSV: /opt/sample345/outs/metrics_summary.csv
7 - BAM: /opt/sample345/outs/possorted_genome_bam.bam
8 - BAM index: /opt/sample345/outs/possorted_genome_bam.bam.bai
9 - Filtered feature-barcode matrices MEX: /opt/sample345/outs/filtered_feature_bc_matrix
10 - Filtered feature-barcode matrices HDF5: /opt/sample345/outs/filtered_feature_bc_matrix.h5
11 - Unfiltered feature-barcode matrices MEX: /opt/sample345/outs/raw_feature_bc_matrix
12 - Unfiltered feature-barcode matrices HDF5: /opt/sample345/outs/raw_feature_bc_matrix.h5
13 - Secondary analysis output CSV: /opt/sample345/outs/analysis
14 - Per-molecule read information: /opt/sample345/outs/molecule_info.h5
15 - Loupe Browser file: /opt/sample345/outs/cloupe.cloupe
16
17 Pipestance completed successfully!
空间转录组测序服务优势
高质量切片：切片、贴片经验丰富，针对不同组织优化了解决方案。
流程化分析：完善的分析流程，准确快速解析空间转录组数据。
标准化内控：丰富的实操经验构建了标准化的内控体系。
专业化团队：资深的技术团队具有多年项目方案设计、实验操作、售后分析等经验。
全流程服务：提供组织冷冻包埋、贴片、切片、透化、建库测序及数据分析的全套服务。
往期推荐
服务科技创新
护航人类健康
扫码关注我们
微信号｜17702139967