免疫研究|银屑病皮肤驻留的先天淋巴细胞向致病效应状态转变
标题：Skin-resident innate lymphoid cells converge on a pathogenic effector state
期刊：Nature（IF=49.962）
导读
银屑病俗称牛皮癣，是一种慢性炎症性皮肤病，病程较长，易复发，有的病例终生不愈，对患者的身体健康和精神状况影响较大。临床表现以红斑，鳞屑为主，全身均可发病。银屑病目前尚无特效疗法，由于本病是一种慢性复发性疾病，不少患者需要长期医治，而各种疗法都有一定的不良反应。有关本病的病因虽然进行过许多研究，但至今尚不十分清楚。我们需要更好地理解导致银屑病病变的免疫系统失调来改善现有疗法。
2021年2月3日在线发表在Nature上的文章“Skin-resident innate lymphoid cells converge on a pathogenic effector state”，通过构建银屑病小鼠模型，结合scRNA-seq、scATAC-seq、体外实验等多种技术来表征皮肤固有淋巴细胞(Innate lymphoid cells, ILCs)及其潜在转变。作者推断银屑病皮肤中ILC以不断变化的状态存在，在银屑病疾病状态下，皮肤驻留的各ILCs细胞亚群可通过多种轨迹转化为致病性ILC3样细胞，从而促进银屑病的发生。而通过抑制ILCs向ILC3转换及ILC3产生有可能成为治疗银屑病的潜在新途径。
科学问题
在健康个体中，皮肤中大多数ILC是 ILC2，通过产生细胞因子IL-5和IL-13维持皮肤稳态。ILC3多出现在人和小鼠的银屑病皮肤中，且数量随着疾病症状减轻而减少，暗示ILC3有助于发病。在疾病进展过程中，ILC2s和 ILC3s 的数量如何以及何时发生变化目前仍然未知。
实验设计
实验分组
对照组：未经处理的幼稚小鼠
实验组：Rag1−/− 小鼠 (敲除T、B淋巴细胞，保留ILCs)、Rag2−/−Il2rg−/− 小鼠(敲除所有淋巴细胞)、Tcrd−/− 小鼠(敲除γδ T细胞)
实验结论
1. 皮肤驻留ILC 启动炎症反应
研究者通过皮下注射IL-23，构建银屑病小鼠模型，导致小鼠炎症反应，皮肤增厚（Fig.1a）。与对照组小鼠相比，在所有淋巴细胞缺失小鼠（Rag2-/-Il2rg-/-小鼠）中，皮肤增厚程度较小，这可能是组织损伤的结果，而在具有ILCs但缺乏T细胞和B细胞的小鼠（RAG1-/-小鼠）中皮肤明显增厚（Fig.1b）。表明，ILC足以驱动银屑病对IL-23的反应。
为了评估疾病发生过程中外周血中循环ILCs与组织驻留ILCs的参与情况，研究者将对照小鼠与经免疫抑制剂FTY720处理的小鼠进行了比较，发现经FTY720处理后，野生型和Rag1-/-小鼠中循环总白血细胞减少，但表型无差别（Fig. 1c）。在初次注射IL-23后消退的炎症和皮肤厚度在二次注射后均显著恶化（Fig. 1d）。表明二次响应不是由于循环ILC募集导致，而是组织驻留ILC引发炎症反应。
Fig.1 IL-23诱导后皮肤ILC驱动的病理特征
2. 基于scRNA-seq结果进行聚类分析
为进一步探索银屑病发生过程中的转录图谱，研究者对IL-23诱导的不同时期的小鼠皮肤ILCs进行了scRNA-seq。根据LDA算法及不同细胞中基因的表达情况，共将所有细胞分为17种主题细胞。其中主题1，“静态样”细胞，高表达静止、幼稚和中枢记忆T细胞的特征基因（Fig. 1f, g）；主题2，ILC2样细胞，高表达ILC2和TH2细胞相关基因和趋化因子基因。主题3，ILC3样细胞，诱导过程中表现出时间依赖性，富含促炎、ILC3和TH17相关基因。主题4，IL2-高表达细胞，高表达IL2、ILC2相关基因（IL13，AREG和IL4），和T细胞相关基因（TNFSF9）。ILCs在银屑病炎症反应过程中形成了一个密集的转录连续体。
3. ILC3样细胞可能通过多种途径产生
ILC3样细胞在IL-23诱导后迅速增加，其比例从诱导前的0.6%增加到第1天的2.1%,第3天的9.7%。ILC3样细胞同时表达其他细胞的特征基因，表明部分已存在的细胞可以转换为ILC3样细胞。因此研究者使用Waddington-OT算法及拟时序分析处理scRNA-seq数据，两种算法的结果均显示，ILC3s由多种状态的细胞转化而来：（1）“静态样”细胞，处于中间态，联合表达主题1和主题3细胞的特征基因（如KLF2与GZMB，Tsc22d3与Il22)（Fig. 2b-d）；(2)ILC2s样细胞，通过高表达不同的趋化因子（Cxcl2和Cxcl3），经由两条不同的路线转化为ILC3（Fig. 2b，e，f)；（3）主题7中部分高表达Ccl5的细胞，高表达热休克蛋白基因（HSPA1A和HSPA1B）（Fig. 2b-f)。进一步分析发现， ILC前体的组织特异性表达基因ZBTB16，PDCD1，Tox2和GIMAP5在ILC3样细胞中高表达，Kit和Itga4在ILC2s中高表达，而基因Il18r1、Tcf7和Tox在多种主题细胞中均表达。ILC3样细胞的异质性可能反映了它们的不同起源；例如， ILC2s- ILC3最先出现，并与衍生自“静态样”细胞的ILC3表达不同的基因。总体而言，以上分析表明IL-23触发了皮肤ILC经多种途径向ILC3样细胞的激活转化。
Fig.2 ILC3样细胞的产生
4. ILCs向ILC3样细胞转化潜力的染色质证据
为了明确染色质是否在IL-23刺激前表现出转变潜力，研究者对幼稚小鼠和IL-23诱导第4天的小鼠ILC进行了scATAC-seq（Fig. 3a）。与scRNA-seq结果相似，ILC2特异性基因在诱导前后都在细胞中高表达，而大多细胞在诱导后才高表达ILC3特异性基因。与此相似，ILC3s和Tħ17细胞的转录因子结合位点可及性在诱导后增加。因此，ILC2样细胞和“静态样”细胞表现出向ILC3样细胞转变的潜力。
Fig.3 幼稚小鼠的皮肤ILCs具有ILC2和ILC3转换潜力
5. 体外验证ILC3样细胞的转变潜力
当受到体外刺激时，皮肤ILCs快速表达与ILC2s或ILC3s相关的基因。为了进一步验证“静态样”细胞向ILC3样细胞转变的潜力，研究者在ILC3诱导、ILC2诱导或对照条件下培养了KLF2+和KLF2-皮肤ILC（Fig. 3d）。在ILC3或ILC2诱导条件下的细胞产生大量的IL-5和IL-17A（Fig. 3e）。同样，产生IL-5的ILC2样细胞在体外诱导条件下也能转换为ILC3样细胞。表明，“静态样”ILC和ILC2存在转变为ILC3样细胞的潜能。
6. 体内试验确认了ILC2到ILC3的转变
通过构建IL-5报告小鼠模型，研究者进一步进行了体内试验验证ILC转变为ILC3样细胞的潜能。结果显示在IL-23诱导后第4天，约10%产生IL-22（或IL-17A）的ILC3，已经产生但目前没有产生IL-5（定义为“exIL-5”），IL-23二次诱导后，该比例显著增加（Fig. 3f, g）。在咪喹莫特诱导的银屑病模型中，也得到了相似结果。以上结果表明在银屑病炎症反应中，体内ILCs具有向ILC3转换的潜能且存在ILC2-ILC3混合状态。
参考文献：
1. Bielecki P, Riesenfeld SJ, Hütter J-C, et al (2021) Skin-resident innate lymphoid cells converge on a pathogenic effector state. Nature 592:128–132. https://doi.org/10.1038/s41586-021-03188-w.
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