空间转录组联合单细胞RNA测序技术揭示对胰岛素有明显敏感性的人类脂肪细胞亚群

文章标题：空间转录组联合单细胞RNA测序技术揭示对胰岛素有明显敏感性的人类脂肪细胞亚群

期刊：Cell Metabolism   

影响因子：27.287

导读

众所周知，人体白色脂肪组织(WAT)可以通过储存和释放脂质，分泌因子调节热量摄入，其在能量稳态中发挥着重要作用。WAT的细胞组成和结构在决定组织功能方面起着关键作用。为了了解WAT的细胞复杂性，单细胞RNA测序技术最近被广泛应用于小鼠和人类脂肪组织细胞类型组成的研究。然而，该技术并不能探究细胞之间的空间位置关系。此外，成熟脂肪细胞占细胞体积的95%，但数量不到40%，该细胞较为脆弱、浮力强，在技术上具有挑战性。因此，大多数关于WAT细胞组成的研究在分析中都会忽略这些细胞，而主要集中在间质血管部分。但关于脂肪细胞形态或组织定位的信息研究很少。

空间转录组学是一种利用空间条形码poly T捕获探针的技术，可以对完整的组织切片进行RNA测序，同时保留组织学信息。这种方法最近被广泛用于揭示肿瘤和中枢神经系统的细胞异质性和空间排列。本研究，作者使用10x Genomics Visium平台进行空间转录组学检测，并将其与单细胞RNA测序数据以及邻域和图像分析相结合，提供了人类皮下腹腔WAT的细胞类型和结构的全面图谱。最终确定了三种表现出不同空间定位和对胰岛素反应差异的脂肪细胞群体，这表明脂肪细胞异质性是WAT胰岛素敏感性的决定因素。

实验设计

样本：10例病人的皮下腹部WAT组织（穿刺样本）

实验及方法：空间转录组测序，stereoscope（单细胞联合空间转录组数据分析）

图 图解摘要

主要结果

1、空间转录组学技术鉴定了人类WAT的多种细胞特征

作者通过空间转录组技术对10例病人的皮下腹部WAT样本进行检测，组织共覆盖了27,937个spots，平均每个切片检测17,303个独特基因和3,280,607个独特分子标识(UMIs)。 将所有样本数据进行合并，聚类，并检测每个spot中的物种组成，最终获得了20个不同的细胞类型。接下来，作者使用stereoscope(一种用于整合空间和单细胞数据的概率方法)将该结果与最近发表的人类WAT间质血管部分的单细胞数据进行反卷积分析，结果表明了空间转录组中的spot包含了由内皮细胞、免疫细胞和祖细胞的特定群体。通过marker基因进行人工矫正后，最终确定了18种细胞（C15:单核细胞，C20：M1型巨噬细胞，C08：M2型巨噬细胞，C16:树突细胞，C10:肥大细胞，C18:B细胞，C13:NK细胞，C5:微脉管细胞，C14传统血管细胞，C17/C19:血管平滑肌细胞，C7/C9/C12：脂肪祖细胞）。其中C07 表达表达成熟的前脂肪细胞/脂肪干细胞标记SP1；C09 表达了编码纤维化和细胞外基质蛋白SP4 ；C12 同时表达SP1和SP4。

图: 对空间和单细胞转录组数据的综合分析确定了人类WAT中18种不同的细胞类别

2、WAT在空间上分为同型和异型细胞群

为了系统地确定WAT组织中的细胞分布，作者计算了每个细胞群体内spots的彼此相邻位置的倾向性，这里称为同型聚类评分(homotypic cluster score)。结果显示，所有免疫细胞、脂肪细胞祖细胞、血管细胞以及成熟脂肪细胞在同型评分中均表现出较大跨度。也就是说，在免疫细胞群体中，M1型巨噬细胞(C20)、B细胞(C18)和肥大细胞(C10) 通常呈簇状分布，而M2型巨噬细胞(C08)和NK细胞(C13)分布在组织各处。

图：同型聚类评分

为了确定不同细胞类之间的空间关系，作者还开发了一种算法来执行成对的异型邻域分析。结果揭示了代表较大血管结构的spots (C14/C17/C19)在血管样组织学特征上彼此靠近。M2型巨噬细胞(C08)经常位于两种脂肪细胞祖细胞附近。这与小鼠研究一致，在小鼠研究中，特定的祖细胞定位于巨噬细胞附近，并形成成脂龛，用于组织修复和重塑。此外，树突状细胞(C16)与其他免疫细胞表现出较高的异型评分，而两类成熟脂肪细胞(C03/C04)相互共定位，并与C06脂肪细胞明显分离。总之，异型邻域分析证明了这一点WAT的空间定义比预期的更明确，具有特定的细胞-细胞关系。

图 异型细胞分析

3、人WAT含有明显的成熟脂肪细胞亚群

本研究共鉴定了三种不同类型的成熟脂肪细胞，它们具有不同的转录谱和空间排列。前者与人类和小鼠的观察结果一致。为了进一步研究，作者定义了每个亚型的标记基因，发现LEP(编码脂肪因子瘦素)、PLIN1/ PLIN4(编码脂滴蛋白perilipin-1和-4)和SAA1/SAA2(编码血清淀粉样蛋白A1和A2急性期蛋白)是各亚型中最独特的基因。作者将这些亚群命名为AdipoLEP、AdipoPLIN和AdipoSAA。AdipoLEP富集于涉及细胞-细胞/基质细胞相互作用的蛋白(如TNS1和SPTBN1)和瘦素信号/分泌修饰因子(PTPN11和DDR2)，包括铁代谢(如FTH1和FTL)的基因。这与Adipo-PLIN形成对比，Adipo-PLIN的标记基因与葡萄糖(TRARG1、GPD1、PFKFB3和MLXIPL)和脂质代谢(如LIPE、DGAT2、PNPLA2、AGPAT2、GPAM和FASN)以及脂肪因子脂联素(ADIPOQ)有关。

虽然AdipoSAA与AdipoPLIN有一些共同的标记基因，但这类基因也富集了多种视黄醇结合脂肪因子(如SAA1, SAA2，以及RBP4编码的视黄醇结合蛋白-4)和涉及视黄醇代谢的酶(CES1和MGST1)。为了证实这三种亚型的标记基因在成熟脂肪细胞中表达，作者分析了大量转录组学数据的配对样本，比较了WAT中分离的脂肪细胞和非脂肪细胞。由此可见，前50个标记基因在脂肪细胞中富集，说明AdipoLEP、AdipoPLIN和AdipoSAA代表不同类型的脂肪细胞。Visium数据的进一步分析显示，这些亚类表现出相互的表达模式，例如，涉及三酰基甘油生物合成和水解的基因在AdipoPLIN中高表达，而在AdipoLEP中表达不足。作者用针对AdipoLEP (DDR2)和AdipoPLIN (HSL，由LIPE编码)标记蛋白的抗体对从人皮下WAT分离的成熟脂肪细胞进行染色，并使用共聚焦显微镜对细胞成像，以验证作者的发现。此外，作者还使用针对CD36 (AdipoPLIN的标记物)和CSDE1 (AdipoLEP的标记物)的抗体对成熟人类脂肪细胞进行了共免疫标记，并观察到相互的染色模式。对于AdipoSAA，作者测试了几种不同的抗体，但都没有显示出足够的特异性。

图 WAT含有三种不同的脂肪细胞亚群

4、脂肪细胞的大小并不是脂肪细胞异质性的决定因素

由于脂肪细胞的大小和数量影响WAT功能，作者确定了这两个参数与已鉴定的脂肪细胞亚型有关。AdipoLEP是最丰富的细胞类群(中位数23%)，其次是AdipoPLIN(中位数14%)和AdipoSAA(中位数8%)。在这个相对较小的队列中，肥胖与非肥胖受试者的比较显示，前者AdipoPLIN细胞较少，而两组间AdipoLEP和AdipoSAA的比例相似。供体年龄并不影响脂肪细胞亚型的比例。为了测试细胞大小是否是脂肪细胞亚型的决定因素，接下来确定了比较小(第1分位)和大(第4分位)脂肪细胞差异表达的基因。这表明AdipoLEP和AdipoPLIN (AdipoSAA spots数量较少，无法进行可靠的分析)都对细胞大小的差异做出了反应，尽管它们的基因有所不同。综上所述,这些分析表明,(1)脂肪细胞亚型的比例影响肥胖,(2)较小和大的脂肪细胞存在基因表达的差异（3）脂肪细胞亚型对脂肪细胞大小的变化,这本身并不能解释脂肪细胞的异质性。

图 ：脂肪细胞的大小并不是脂肪细胞异质性的主要因素

5、体内脂肪细胞亚群对胰岛素的反应不同

接下来作者分析了脂肪细胞亚型对组织功能的贡献。对来自56名明确表型女性的队列的WAT转录组数据进行了综合分析，其中还对新鲜分离的脂肪细胞进行了脂肪分解/脂肪生成测量。作者观察到，在比较这56名女性时，AdipoPLIN、AdipoLEP和AdipoSAA标记基因形成了单独的、共同调控的集群。AdipoPLIN在肥胖中所占的比例有所降低，简单回归分析显示AdipoPLIN与BMI之间存在负相关。AdipoSAA与BMI呈负相关，而AdipoLEP与BMI呈正相关。同样，这与受试者的年龄没有显著关联。通过对BMI进行多元回归分析， AdipoPLIN与两种脂解指标之间存在正相关。与此相反，AdipoLEP与这些参数没有或弱负相关。对于胰岛素刺激的脂肪生成，AdipoPLIN显示正相关，AdipoLEP显示负相关。AdipoPLIN和Adipo LEP与HOMA-IR的相互关联证实了脂肪细胞亚型和全身水平的胰岛素敏感性之间的关系。相比之下，AdipoSAA与任何研究参数均无显著相关性。总之，这表明AdipoPLIN与AdipoLEP和AdipoSAA相比，与更明显的胰岛素反应有关。

图 AdipoPLIN，而不是AdipoLEP或AdipoSAA，与脂肪细胞和全身胰岛素敏感性有关

为了在人体内测试这一发现，作者在高胰岛素-正血糖钳夹2小时后，从10个个体中的4个收集了WAT样本，并用Visium分析了效果。稳定状态下的平均胰岛素浓度是空腹状态的10倍，血糖控制在4.5-5.5 mmol/L，从葡萄糖处理速率(m值)可以看出，4例患者胰岛素敏感性差异较大。高胰岛素血症的Visium数据与禁食状态下获得的样本质量相似，与胰岛素应答相关的基因的表达在两组间也基本一致。这些数据与之前报道的高胰岛素钳夹队列的大量组织RNA测序结果一致，表明该研究分析捕捉到了胰岛素的急性反应。在胰岛素反应基因中，只有非常有限的一组是三种脂肪细胞亚型中的任何一种的标记，这表明尽管胰岛素诱导了一个清晰和快速的转录在这个时间框架内，它本身并不是脂肪细胞异质性的驱动因素。由于这些分析是在所有spots进行的，它们不能提供是否个体脂肪细胞亚型对胰岛素的反应不同。因此，根据细胞类别将胰岛素反应分析进行了划分。对于脂肪细胞，这种方法揭示了不同亚群之间的清晰分离，在AdipoPLIN中有多个基因对胰岛素有显著反应，在AdipoSAA中则少得多，而在AdipoLEP中只有一个基因。考虑到四个受试者在胰岛素敏感性上表现出显著差异，作者评估了个体之间对胰岛素的转录反应是否存在数量差异。分析表明，体内对胰岛素的转录反应主要归因于AdipoPLIN，而其他脂肪细胞亚型在很大程度上对高胰岛素血症没有反应。

参考文献：Jesper Bäckdahl，Lovisa Franzén，Lucas Massier, et al. Spatial Mapping Reveals Human Adipocyte Subpopulations with Distinct Sensitivities to Insulin,Cell Metabolism, Aug. 10, 2021, DOI:10.1016/j.cmet.2021.07.018

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