内容过硬的单细胞和常规联合分析

仅凭几个单细胞转录组（scRNA-seq）样本发高分的时代即将过去，如果经费不够做大样本的单细胞测序，将单细胞组学与传统组学完美结合，一样也可以发高分。

文章简介

今天要介绍的文章发表在Cancer Discovery上，该期刊近几年影响因子犹如坐了火箭（2018年IF：26.37，2019年IF：29.49，2020年IF：39.40），完全不顾及老大哥Cancer Cell的脸面，当然影响因子高主要取决于文章质量过硬。来看看为什么这篇文章能发在如此高分的期刊上！

背景知识

最近的一些临床试验表明，化学疗法和免疫疗法联用可以进一步提高肿瘤患者的生存，说明化疗在杀伤肿瘤细胞的同时，也会重塑肿瘤免疫微环境，创造免疫治疗有利的条件！

结果解读

病人特征和研究样本

本研究共入选12个转移性晚期胃癌（AGC）患者，其中5个为HER-2阳性。5个患者对一线化疗表现出部分反应（PR），分别有3和4个患者为病情稳定（SD）和疾病进展（PD）。治疗前，所有样本都做了全外显子组 (WES) 和转录组测序 (WTS) 。治疗中，5个样本做了WES和WTS（图 1A，图 1B）。作者分析了治疗前和治疗中样本的WES数据，与之前的报道一致，他们观察到TCGA胃癌队列中富集的基因突变，包括染色质组蛋白修饰符和转录因子（图 1C-D）。为了表征在 AGC 中产生点突变的突变过程，作者分析了COSMIC目录中来自AGC组织的18个全外显子组序列（12个治疗前和6个治疗中样本）的突变特征（图1E-F）。大多数单核苷酸替换是C:G>T:A转换。突变谱表明，这些突变特征与年龄相关，是AGC体细胞SNV的原因。总体而言，在2个周期的铂类化疗中观察到的早期基因组变化有限，这表明早期突变不是肿瘤微环境（TME）改变的主要媒介。

图1入组患者的研究概述和基因组图谱

化疗将胃癌TME重塑为免疫反应特征

接下来，作者把注意力集中在TME的免疫成分上。他们将最近发表的泛癌TME特征应用于12个治疗前和6个治疗中样本的RNA-seq数据，不过响应者和非响应者之间TME组成没有明显的差别（图 2A）。基因集变异分析（GSVA）结果显示，治疗前和治疗中样本存在不同的富集模式 (图 2B)。比如，与M2极化巨噬细胞（抗炎、免疫抑制）相关的基因在治疗样本中被明显抑制（P=0.009），表明常规化疗期间M1/M2复极化增加。在治疗样本中观察到PD-1通路显著激活 (P=0.033)，表明化疗正在重塑AGC的TME，尤其是响应者。值得注意的是，治疗中PD-1通路和炎症小体的增加在响应者中更为常见。相反，Wnt通路的增加在非响应者中富集，并且可能起到阻止T细胞浸润的作用。

图2化疗重塑晚期胃癌的肿瘤微环境

化疗对T细胞的调节

为了描绘化疗对AGC微环境的改变，作者分析了治疗前 (n=11) 和治疗中 (n=7) 活检的scRNA-seq数据。在过滤低质量细胞并用Harmony校正后，总共收集了18,911个细胞（10,651个细胞来自治疗前样本，8,260个细胞来自治疗中样本内）。进行无监督聚类后，鉴定出7种主要细胞类型：上皮细胞 (n=3,056)、基质细胞 (n=3,750)、T细胞 (n=7,145 )、NK细胞 (n=624)、髓细胞 (n=1,902)、B 细胞 (n=1,877)、血小板和未定义细胞 (n=557) (图 2C)。T细胞比例在治疗样本中显示出增加的趋势，尤其是HER2阴性样本（图 2D，上图）。与治疗前样本（median 39.5%，range 35.0-54.7%）相比，响应者在治疗样本中的效应 CD8细胞比例更高（median 46.1%，range 45.3-48.0%）（图 2D，右中）。另一方面，在非响应者中，与治疗前样本（median 10.5%，range 5.0-42.1%）相比，治疗样本中耗竭T细胞比例增加（median 14.0%，range 8.7-33.8%）（图 2D，右中）。与非响应者相比，响应者在治疗前样本中的肿瘤相关巨噬细胞 (TAM) 比例更高（median 79.1%，range 37.0-97.7%），并且在治疗后比例增加（中位数 86.7%，范围 75.0- 92.3%）（图 2D）。

为了深入了解化疗期间T细胞丰度增加的机制，作者研究了上皮细胞亚群的免疫信号通路（图 2E）。值得注意的是，损伤相关分子模式家族(DAMPs)中代表性基因的表达，包括膜联蛋白 A1 (ANXA1) 和高迁移率组框 1 (HMGB1)，在HER2阳性患者化疗后增加（P=0.001）和HER2阴性(P<0.001)AGC患者。此外，与先天性免疫信号传导有关的基因，例如cGAS和STING在HER2阳性治疗样本中表达增加，这与先前的数据一致，即HER2抑制诱导STING通路激活。总的来说，这些数据表明，传统化疗可以通过重组T细胞区室和在一部分患者的肿瘤细胞中诱导先天免疫通路来促进AGC的抗肿瘤炎症。

化疗对肿瘤相关巨噬细胞的重编程

作者假设抗原呈递细胞可能在化疗环境中重组TME和募集T细胞方面发挥重要作用。因此，他们将1,902个髓细胞进一步分成五个亚群，并主要关注TAM（n = 1,425）（图 3A）。差异表达分析确定了治疗前和治疗中细胞间存在1,003个差异表达基因。其中，S100A8、S100A9、IRF1、ITGAX等促炎基因和HLA-B和HLA-C等MHC I类抗原呈递基因在治疗样本中显着上调，而SPP1、LGALS1、APOE和APOC1等抗炎分子在化疗期间下调（图 3B）。接下来，为了识别 scRNA-seq 数据中的富集通路，作者计算了经典通路的模块分数。与前面的结果一致（图 2B），治疗样本中与M2巨噬细胞相关的基因表达降低，尤其是在HER2阴性样本中（P<0.001）。另一方面，与骨髓分化、抗原加工和呈递以及 MHC1 分子上的肽负载相关的基因在治疗中表现出更高的表达（图 3C）。

为了更好地了解化疗环境中巨噬细胞表型的重组，作者使用Slingshot构建了TAM的分化轨迹（图3D），观察到两条不同的轨迹：一条走向M2巨噬细胞，另一条走向M1巨噬细胞。在治疗前样本中，M2巨噬细胞的比例（91.9%）远高于M1巨噬细胞（8.1%）。然而，治疗样本中的TAM亚群偏向于M1巨噬细胞（35.8%）。总之，这些数据表明化疗导致M1/M2极化增加。

图3化疗期间TAM的转录重编程

一线化疗对早期TME重塑的独立外部验证

为了主要队列的发现，作者又收集了17个原发性胃肿瘤患者化疗前后的肿瘤样本，并进行全转录组测序。使用CibersortX算法的细胞类型去卷积揭示了治疗中TME内效应细胞亚群增加 。此外，GSVA算法在治疗样本中显示出显着减少的M2巨噬细胞和激活的PD-1信号传导，验证了之前的scRNAseq分析结果（图 4A）。有趣的是，作者观察到与主要队列一致的治疗中富集的通路，包括T细胞受体信号传导、共刺激和效应细胞。

作者再次使用泛癌TME特征将每个肿瘤样本分为四个先前定义的TME亚型 (图 4B)。在大多数患者中，他们观察到一个CTX周期后的动态变化。具体而言，14个具有免疫耗竭或纤维型的治疗前样本中，有一半在治疗期间变成免疫有利的表型（图 4E）。总的来说，这些结果表明抗癌治疗期间的早期TME重塑。

图4化疗期间微环境重塑的独立验证

T细胞上LAG-3表达的早期增加与一线化疗缺乏受益有关

鉴于化疗具有明显的免疫重塑作用，作者做出一个假设：无法有效调节T细胞组成，特别是耗竭T细胞，可能在化疗不响应的原因。他们将7,145个T细胞分为六个亚群：Treg（n=684）、幼稚CD4（n=863）、增殖T细胞（n= 51)、记忆CD8 (n=1,475)、效应CD8 (n=3,031) 和耗竭CD8 (n=1,041) (图 5A)。根据已知的发育分组，将耗竭CD8细胞进一步细分为4个阶段。为了了解非响应者之间的共同特征，作者关注对化疗耐受EP-05、EP-07 和 EP-08。他们发现两名患者的原发性胃肿瘤中有MET扩增，所有三名患者在基线时均为PD-L1阴性(CPS = 0)，并且未能在化疗中上调PD-L1表达。有趣的是，TIGIT表达在MET扩增患者的T细胞中富集（图 5B）。总体而言，与野生型MET患者相比，MET扩增患者的终末分化T细胞比例更高（图 5B）。

在一名进展性疾病患者 (EP08)中， 治疗中的 LAG3+细胞 (n=35, 0.3%)和CD20+细胞 (n=292, 2.5%)的比例高于治疗前肿瘤(LAG3+细胞, n=3) , 0.04%;CD20+细胞, n=80, 1.09%) (图 5E)。通过mIF中的LAG3蛋白表达以及scRNA-seq中的LAG3 mRNA表达评估，作者在另外两名原发性进展患者（EP05、EP07）中也观察到了类似的现象（图5F）。尽管受限于患者数量少，对化疗不响应的患者未能有利地重塑他们的TME，T细胞浸润的变化很小，但LAG3表达和B细胞浸润。相反，在化疗响应者中未观察到这些不利的TME特征。

图5非响应者LAG3+细胞增加

结语

作者先从Bulk RNA-seq数据入手，合理利用常用的免疫特征基因集，发现化疗前后TME中明显不同的免疫特征。接着，利用scRNA-seq数据深入解析TME中免疫成分的变化。对于响应者，化疗会诱导的NK细胞浸润、巨噬细胞复极化和抗原提呈增加；而对于非响应者，LAG3表达增加且树突状细胞风度降低，强调了化疗响应和耐药期间肿瘤微环境的重塑。然后呢，收集一组独立样本又是一波Bulk RNA-seq，又是免疫特征基因集分析，又得到一致的结果，完美收官！

参考文献

Kim, Ryul et al. “Early Tumor-Immune Microenvironmental Remodeling and Response to Frontline Fluoropyrimidine and Platinum Chemotherapy in Advanced Gastric Cancer.” Cancer discovery, candisc.0888.2021. 21 Dec. 2021, doi:10.1158/2159-8290.CD-21-0888

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