不知道大家是否还记得去年7月底生信人给大家推送的肿瘤乳酸热点专题，主要对乳酸在肿瘤进程中的重要作用进行总结，还分享了TME相关乳酸代谢纯生信新思路。去年我们还在感慨6月推出的焦亡思路，10月份一检索就已经三篇文章了，还好乳酸思路尚有机会。好巧不巧，今年的乳酸思路又又又又成真了。一篇Cancer Cell（IF: 2020，31.7436; 2021预测，34.949），一篇Frontiers in Oncology（IF: 2020，6.2437; 2021预测，5.452）再一次敲响肿瘤乳酸代谢的大门。这里小编就不得不凡尔赛一下了，我们对肿瘤研究热点的把握就是这么迅速，敏捷，精准，吼吼！毕竟肿瘤代谢和肿瘤免疫那么火，发文那么快，影响因子那么高也是情理之中啦。今天小编想和大家分享的第一篇就是关于乳酸与肿瘤免疫相关的分析文章，Cancer Cell出品，质量有保证哦。Lactic acid promotes PD-1 expression in regulatory T cells in highly glycolytic tumor microenvironments 乳酸在高糖酵解性肿瘤微环境中促进调节性T细胞PD-1的表达在肿瘤微环境(TME)中，表达PD-1的CD8+ T细胞和调节T细胞之间的平衡决定PD-1阻断治疗的临床疗效。然而，决定这种平衡的因素仍然是未知的。在myc扩增肿瘤和肝脏肿瘤等高糖酵解性肿瘤中，与效应T细胞相比，PD-1在Treg细胞表达更高。在低糖环境下，Treg细胞通过肿瘤细胞消耗葡萄糖，通过单羧酸转运体1 (moncarboxylate transporter 1, MCT1)主动吸收乳酸(LA)，促进NFAT1转位入核，从而增强PD-1的表达，而效应T细胞的PD-1表达被抑制。PD-1阻断激活表达PD-1的Treg细胞，导致治疗失败。因此，研究者认为LA在高糖酵解TME中通过上调PD-1的表达，是TME中Treg细胞功能的活跃检查点。
图片摘要.乳酸在高糖酵解性肿瘤微环境中促进调节性T细胞PD-1的表达
1.肿瘤的糖酵解活性与TME中eTreg（效应Treg）细胞表达PD-1相关研究者首先对TME中影响Treg细胞表达PD-1的因素进行探究。Treg细胞通常与主转录因子FOXP3的表达有关。因此，研究者根据naive T细胞标记物CD45RA和FOXP3的表达水平对人类Treg细胞进行分类:naive Treg细胞(CD45RA+ CD25low FOXP3low CD4+) (I)；eTreg细胞(CD45RA- CD25high FOXP3high CD4+) (II);和非Treg细胞(CD45RA- CD25low FOXP3low CD4+) (III)。研究者基于手术切除胃癌(GC)和非小细胞肺癌(NSCLC)的表达谱数据（GSE190139，GSE190141，GSE152040），对PD-1高表达的eTreg细胞(PD-1高表达的eTreg细胞)与PD-1低表达的eTreg细胞(PD-1低表达的eTreg细胞)肿瘤特点进行探究(图1A)。基因集富集分析(GSEA)发现，在PD-1高表达eTreg细胞的GC和NSCLC肿瘤组织中，糖酵解相关基因集和myc靶向基因集显著富集(图1B)。与PD-1含量低的eTreg细胞相比，PD-1含量高的eTreg细胞中LDHA和MYC的基因表达更高(图1C)。MYC是糖酵解的重要调节因子。研究者进一步对肿瘤表达MYC的免疫效应进行探究，发现肿瘤浸润性CD8+ T细胞与eTreg细胞的比值以及肿瘤浸润性CD8+ T细胞的PD-1表达在myc过表达(MYC high)的GCs和nsclc中显著低于MYC low肿瘤(图1D和1E)。相比之下，肿瘤浸润的eTreg细胞在MYC high GCs和NSCLC中的PD-1表达显著高于MYC low的 GCs和NSCLC(图1E)。因此，研究者推测eTreg细胞在高糖酵解肿瘤中PD-1的表达可能上调。对来自NSCLC原发病灶和肝转移病灶的成对标本进行免疫组化(IHC)分析，研究者发现与原发病灶相比，肝转移病灶中糖酵解相关蛋白，包括LDHA、PDK1和HIF1a的表达显著升高(图1F)。肝转移灶中FOXP3+ CD4+ T细胞的PD-1表达也明显高于原发灶，而CD8+ T细胞的PD-1表达降低(图1G和1H)。
图1.eTreg表达的PD-1在高糖酵解性肿瘤中升高2.LA通过MCT1增强eTreg细胞的PD-1表达，但不增强CD8+ T细胞的PD-1表达研究者继续对eTreg细胞在糖酵解性肿瘤中比CD8+ T细胞表达更高PD-1的机制进行探究。从手术切除的NSCLC标本中制备4个肿瘤浸润T细胞亚群，PD-1+或PD-1-的CD8+ T细胞和PD-1+或PD-1-的eTreg细胞。对四个T细胞亚群的基因表达进行富集分析，以确定那些在eTreg细胞中与PD-1表达正相关，而在CD8+ T细胞中没有的基因(图2B)。在PD-1+ eTreg细胞稳健表达的富集基因中，研究者注意到一个LA转运蛋白，编码MCT1的Slc16a1(图2C)。鉴于LA是肿瘤糖酵解的最终产物，研究者探究是否可以通过MCT1吸收LA，从而诱导eTreg细胞表达PD-1。事实上，PD- 1高 eTreg的晚期GC中LA含量明显高于PD- 1低eTreg细胞(图2D)。进一步采用流式细胞术检测各组T细胞亚群中MCT1蛋白的表达。与LA代谢相关的MCT1和LDHB在PD-1+ eTreg细胞中表达显著升高，而在PD-1+ CD8+ T细胞中表达明显降低(图2E和2F)。MCT1的细胞表面表达是通过与CD147的紧密相互作用而促进的。与eTreg细胞一致，CD147是由激活的人类Treg细胞特异性表达的。对来源于人类高级GC样本和小鼠肿瘤模型的肿瘤浸润淋巴细胞流式细胞术分析表明，eTreg细胞中MCT1、CD147和LDHB蛋白表达显著升高(图2G, 2H)。公共数据集中的染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)数据表面SLC16A1和BSG(编码CD147)基因都含有FOXP3结合位点。在FOXP3过表达的细胞中，MCT1和CD147的表达明显高于对照组细胞，提示FOXP3可直接促进eTreg细胞MCT1和CD147的表达。研究者进一步对每个T细胞亚群中LA和PD-1表达之间的直接联系进行探究。在低糖条件下，用抗CD3和CD28单克隆抗体(mAbs)刺激CD8+ T细胞和eTreg细胞。随着LA浓度的增加，eTreg细胞的PD-1表达显著升高。相比之下，CD8+ T细胞中PD-1的表达与LA浓度成比例下降(图2I和2J)。当Treg细胞通过MCT1从微环境中摄取LA时，LA在Treg细胞中被代谢为磷酸烯醇丙酮酸(PEP)。PEP被称为代谢免疫检查点，可以激活T细胞功能。PEP增加细胞质中的钙离子(Ca2+)浓度，促进NFAT1易位入核。从本工作的数据来看，LA浓度的增加导致Treg细胞中PEP含量、Ca2+含量和核内NFAT1表达显著升高，而在CD8+ T细胞中，在低糖条件下刺激T细胞时，则没有升高(图2K、2L)。进一步评估LA浓度对低糖环境下CD8+ T细胞和Treg细胞增殖和凋亡的影响。与CD8+ T细胞相比，eTreg细胞在低糖条件下因LA增加而增殖旺盛，凋亡较少。此外，在低LA或高LA环境下进行T细胞抑制试验，研究者发现eTreg细胞在高LA(低葡萄糖)浓度下变得更受抑制(图3A)。
图2.LA通过MCT1诱导eTreg细胞表达PD-1接着，研究者进一步探究在高LA条件下MCT1表达与Treg细胞抑制活性之间的相关性。在低葡萄糖和高LA条件下，Slc16a1在Treg细胞中的遗传消融降低抑制活性，但在低LA(正常葡萄糖)条件下却没有(图3B和3C)。综上所述，在低糖高LA环境下，eTreg细胞通过MCT1(由FOXP3控制)摄取LA，从而上调PD-1的表达，而在CD8+ T细胞中则呈相反趋势。3.PD-1阻断增强高LA环境下eTreg细胞的免疫抑制活性研究者进一步探究PD-1阻断是否可以增强低糖高LA条件下eTreg细胞的抑制功能。更高浓度的LA通过PD-1阻断逐渐降低CD8+ T细胞IFN-g的生成；使用更高浓度LA的抗PD-1单抗增强eTreg细胞的抑制活性。在低LA或高LA条件下进行抑制实验。在低LA环境中，通过添加抗PD-1单克隆抗体可以增加Tresp细胞的增殖，而在高LA环境中则不能(图3E和3F)。当Tresp细胞与eTreg细胞在低LA环境下共培养时，Tresp细胞优先被抗PD-1单克隆抗体激活，与eTreg细胞的抑制情况类似(图3E)。相比之下，在高LA环境下，Tresp细胞与eTreg细胞共培养时，eTreg细胞的抑制活性增强，PD-1阻断使Tresp细胞增殖严重受损，提示PD-1+ eTreg细胞优先激活(图3F)。因此,PD-1封锁可以增强eTreg细胞在低糖高乳酸环境下的活性,导致CD8 + T细胞功能被抑制,表明高la诱导的PD-1高eTreg细胞与PD-1阻断治疗失败之间的直接联系。
图3.Treg细胞的MCT1表达对于维持高LA环境下的抑制活性至关重要
4.MYC表达通过调节糖酵解活性和创造高LA TME来调节PD-1表达的平衡MYC high肿瘤的临床样本数据(图1D和1E)促使研究者使用动物模型评估肿瘤MYC表达对TME中T细胞PD-1表达的影响。研究者建立MYC过表达的MC-38(小鼠结肠癌细胞株)和B16-OVA(小鼠黑色素瘤细胞株)(图4A)。糖酵解的关键调控因子己糖激酶2和LDHA在MYC过表达细胞株中的表达高于模拟细胞株(图4A和4B)。因此，与模拟细胞株相比，MYC过表达细胞株在体外和体内产生的LA数量显著增加(图4C和4D)。MYC过表达的MC-38肿瘤在免疫缺陷和免疫能力低下的小鼠中都比对照肿瘤生长得更快(图4G)。因此，MYC过表达的MC-38肿瘤中CD8+ T细胞的数量(计数/肿瘤重量)明显低于对照组(图4E)。在MYC过表达的MC-38肿瘤中，与对照肿瘤相比，Treg细胞的PD-1表达显著升高。尽管在MYC过表达的MC-38肿瘤中，CD8+ T细胞的PD-1表达显著低于对照组(图4F)。抗PD -1单克隆抗体的抗肿瘤作用在MYC过表达的MC-38肿瘤中显著减弱(图4G)。在B16-OVA模型中也观察到类似的结果(图4E、4F和4H)。在MYC过表达的MC-38肿瘤中，抗PD -1单抗处理显著增强激活标记物(CTLA-4、ICOS和GITR)的表达和Treg细胞的增殖。而在对照肿瘤中，抗PD-1单抗处理后未观察到Treg细胞的功能和增殖增强(图4I, 4J)。抗原提呈细胞(APCs)是Treg细胞的重要靶点，在MYC过表达肿瘤中，抗PD-1单抗治疗抑制TME中APCs的成熟。在MYC过表达肿瘤中，抗PD-1单克隆抗体并没有增加TME中MuLV-15E四聚体+ CD8+ T细胞和TNF-a+ IFN-g+ CD8+ T细胞的频率(图4K和4L)。因此，MYC过表达肿瘤TME，尤其是Treg细胞中丰富的LA增加PD-1的表达，从而导致PD-1被阻断后Treg细胞抑制活性增强而引起的治疗耐药性。
图4.肿瘤细胞表达MYC可促进糖酵解并导致对PD-1封锁的抵抗
5.肝内肿瘤在TME中增强糖酵解，促进Treg细胞PD-1的表达临床样本数据(图1G和1H)表明，在肝转移瘤中eTreg细胞诱导PD-1表达。将MC-38或B16-OVA细胞接种于C57BL/6小鼠皮下或直接接种于肺或肝脏中。免疫印迹检测显示肝内肿瘤通过HIF1a高表达PDK1和LDHA(图5A和5B)。肝内肿瘤组织间质液中LA浓度显著升高(图5C)。与MYC过表达肿瘤相似，肝内肿瘤中CD8+ T细胞的数量和PD-1表达明显减少，而Treg细胞的PD-1表达明显增强(图5D和5E)。抗PD -1单抗治疗对肝内肿瘤没有抗肿瘤作用(图5F和5G)，而是激活肝内肿瘤中的Treg细胞(图5H、5I)，并抑制APCs的成熟。因此，在肝内肿瘤中，抗PD -1单克隆抗体并不能增强肿瘤响应和/活化的CD8+ T细胞(图5J和5K)。总之，肝内TME中丰富的LA诱导Treg细胞表达PD-1，导致抗PD-1单抗治疗的耐药。
图5.肝内肿瘤诱导缺氧微环境，抑制PD-1阻断效果6.通过抑制Treg细胞LA代谢，可以克服MYC过表达肿瘤对PD-1阻断的耐药研究者进一步探究靶向肿瘤细胞的LDHA或TME中Treg细胞的MCT1是否可以恢复MYC过表达肿瘤中抗PD -1单克隆抗体的疗效。研究者发现不论是在过表达MYC细胞中敲除LDHA，还是使用药物(GSK2837808A LDHi)抑制LDHA，都可以减少LDHA的产生，逆转CD8+ T细胞和Treg细胞中PD-1的表达平衡，抑制Treg细胞的抑制功能，使抗PD-1单克隆抗体的疗效显著提高（(图6A- 6H）。因此，可以通过靶向肿瘤中的LDHA或Treg细胞的MCT1来克服MYC过表达肿瘤对PD-1阻断的耐药性。
图6.通过抑制Treg细胞LA代谢，可以克服MYC过表达肿瘤对PD-1阻断的耐药性7.通过靶向Treg细胞LA代谢恢复在肝内肿瘤中的抗PD-1阻断作用研究者进一步测试TME中靶向肿瘤细胞的LDHA或Treg细胞的MCT1是否可以增强抗PD -1单克隆抗体在肝内肿瘤中的疗效。与MYC过表达肿瘤相似，LDHA的遗传和药理抑制均能减少肝内肿瘤中LA的含量，逆转T细胞的PD-1表达平衡，抑制Treg细胞的抑制功能，从而提高了抗PD-1单克隆抗体的疗效(图7A- H)。此外，对Treg细胞MCT1的遗传和药理抑制降低PD-1表达，增加肝内TME中活化的CD8+ T细胞，从而显著增强抗PD-1单克隆抗体的抗肿瘤疗效(图7I-P)。因此，抗PD -1单克隆抗体的抗肿瘤作用是通过抑制肿瘤中的LDHA或肝内肿瘤中Treg细胞的MCT1而恢复的。
图7.靶向Treg细胞的LA代谢恢复在肝内肿瘤中的抗PD-1阻断作用
8.基于糖酵解相关分子表达预测PD-1阻断的有效性在接受PD-1阻断的胃癌、非小细胞肺癌和恶性黑色素瘤患者中，LDHA或MYC高表达的患者表现出较短的无进展生存期(PFS)(图8A、8B)。与无MYC扩增的胃癌患者相比，有MYC扩增的胃癌患者PFS显著缩短(图8C)。有肝转移的胃癌和NSCLC患者接受PD-1阻断治疗后，PFS显著低于无肝转移的患者(图8D)。总之，MYC扩增和肝转移以及免疫阻断的耐药性有关。
这篇文章的主要内容就是这些，研究者主要对乳酸在高糖酵解性肿瘤微环境中促进调节性T细胞PD-1的表达进行机制分析，发现高糖酵解性肿瘤消耗葡萄糖，释放过量的LA，增加PD-1的表达，抑制Treg细胞的活性，从而导致部分PD-1阻断治疗无效，通过靶向Treg细胞LA代谢可以恢复在肝内肿瘤中的抗PD-1阻断作用，充分说明乳酸与免疫治疗间存在的紧密关联。相比于第一篇文章而言，第二篇就简单多啦，是一篇纯生信的代谢分析文章。我们在这里就只做简单介绍，感兴趣的小伙伴们就自行学习啦。皮肤黑色素瘤(SKCM)是一种以高度免疫细胞浸润为特征的皮肤癌类型。乳酸是SKCM肿瘤微环境(TME)的主要代谢产物，但其潜在功能尚不清楚。在这篇文章中，研究者对TCGA数据库中SKCM患者的乳酸相关基因对预后和免疫检查点抑制剂(ICIs)响应的预测价值进行探究。首先，研究者基于TCGA和GTEX数据识别出在正常皮肤和SKCM样本中发生差异表达的乳酸相关基因，并基于单因素cox分析筛选出与预后相关的差异表达乳酸相关基因。进而基于多因素cox分析和LASSO cox分析构建预后特征，比较不同预后风险患者在预后，临床特征，生物学功能，肿瘤微环境和免疫响应等方面的差异，并在独立数据集合中进行验证。
1.基于TCGA和GTEX数据识别出在正常皮肤和SKCM样本中发生差异表达的乳酸相关基因，对乳酸相关差异表达基因进行GO和KEGG功能富集分析，并构建乳酸相关差异表达基因的蛋白质互作网络。
图10. 差异表达乳酸相关基因的识别及其功能富集分析
2.通过无监督一致聚类方法，基于差异表达的乳酸相关基因，将SKCM样本分为不同的聚类(K = 2 ~ 9)，并根据共识矩阵、共识CDF曲线和CDF曲线下面积的相对变化，进行最优划分。不同类别患者的预后生存时间以及溃疡状态等临床特征存在差异。
3.首先基于单因素cox分析筛选出与预后相关的差异表达乳酸相关基因，进而基于多因素cox分析和LASSO cox分析构建预后特征，预后特征基因表达与患者预后有关。
图12.基于TCGA数据构建构建乳酸相关基因的预后特征
基于预后特征风险打分将患者进行划分，与低风险打分患者相比，高风险组患者的预后更差。NARS2等特征基因在在两套数据的相同类型患者中，表达趋势一致。
4.不同风险组患者展现出不同的预后特征，并且可以作为SKCM患者的独立预后因素，具有比较强的临床实用性。
6. 识别不同风险组患者的差异表达基因，并对其进行富集分析，以识别预后特征相关的生物学过程和通路。
8.乳酸风险评分与肿瘤微环境相关，不同风险评分患者展现出不同的肿瘤微环境。
9. 乳酸风险评分与肿瘤免疫治疗响应相关，不同风险评分患者对肿瘤免疫治疗响应不同。
细心的友友们一定能发现，不管是之前的m6A，细胞焦亡，还是现在的乳酸代谢等等等，很多思路的研究方法都一致，会很疑惑创新性在哪，甚至会认为这是种重复，没啥意义。但咋说呢，现阶段研究预后的手段就那么几种，文章的灵魂不仅在于研究方法，更在于研究疾病和研究内容的紧密关联。研究方法创新性不强，那我们完全可以在研究内容上杀出重围，闯出自己的一片天空啊。不知道如何把握研究内容，掌握研究热点的小伙伴也不要担心，赶快跟上我们的步伐，大家一起杀出重围吧。更多生信分析问题咨询：185012326359(微信同号） 18501236255（微信同号）
1.Lactic acid promotes PD-1 expression in regulatory T cells in highly glycolytic tumor microenvironments2.Identification of Lactate-Related Gene Signature for Prediction of Progression and Immunotherapeutic Response in Skin Cutaneous Melanoma