华中大陈莉莉/武汉理工樊李红《Carbohyd. Polym.》：负载nHA的明胶/藻酸盐水凝胶具有物理和生物活性用于颌面骨修复

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考虑到其对功能和结构修复的要求，临界大小的颌面骨缺损一直是一项艰巨的临床挑战。在本研究中，由明胶 (Gel)、20 mg/mL 海藻酸二醛 (ADA)、4.5 mg/mL Ca ²⁺制备可注射原位形成双交联水凝胶和硼砂。复合水凝胶的改进性能可以很好地适应和覆盖面部骨骼缺损的不规则几何形状，支撑面部结构并传导咀嚼力。他们通过纳米羟基磷灰石 (nHA) 的装饰，创新性地构建了一种具有生物活性的多孔结构。高度有序、均匀且尺寸受限的多孔表面充当了一个交互式成骨平台，用于巨噬细胞和骨髓衍生干细胞 (BMSCs) 之间的交流和相互作用。有效的巨噬细胞-BMSC 串扰很好地解释了负载 nHA 的明胶/藻酸盐水凝胶 (nHA@Gel/ADA) 在修复临界尺寸颅骨缺损中的显着效率。总的来说，这里构建的复合水凝胶可能作为复杂颌面骨缺损修复过程中的一种有前途的替代方案。

华中科技大学协和口腔医院陈莉莉教授和武汉理工大学化学化工与生命科学学院樊李红教授合作开展了一种在新型 nHA@ADA/Gel 中同时增强物理特征和生物活性效应。双交联策略赋予水凝胶优异的可注射性、自愈性和形状适应性，是修复面部不规则骨缺损所必需的。nHA的修饰不仅有助于水凝胶增强机械性能，而且促进表面外观重塑为尺寸受限的多孔表面，适用于巨噬细胞和骨髓间充质干细胞之间的有效串扰和随后的成骨。这里提出的nHA@ADA/Gel成功地整合了成骨的固有特征和生物活性功能，因此为开发专门用于修复颌面部骨缺损的新型生物材料提供了广阔的机会。相应结果以题为 “nHA-loaded gelatin/alginate hydrogel with combined physical and bioactive features for maxillofacial bone repair”发表于Carbohydrate Polymers期刊。

图1.化学交联和离子交联（Ca²⁺）并用nHA修饰的复合ADA-Gel水凝胶示意图。nHA中动态解离的PO₄^3-和Ca²⁺与生物聚合物相互作用形成紧密紧凑的结构。其在颌面部骨缺损中的应用获得了改善的生物医学和力学性能。通过巨噬细胞和骨髓间充质干细胞之间的交互调节，复合水凝胶显着加速了骨修复过程。

图2展示了复合水凝胶的物理化学性质以及在颌面骨修复中的适用性。同时，通过流变学研究证明了复合水凝胶具有优异的粘弹性和可注射性。结果表明，添加30% nHA颗粒可以改善水凝胶的粘弹性行为，这与HA-30拥有的最高粘度一致。图3显示了nHA@ADA/Gel粘附性能与力学性能，由于面部骨组织承担着支持咀嚼、吞咽和语言等功能性机械力的责任，因此作为骨愈合材料的水凝胶应具有足够的机械强度和韧性。结果表明HA-30组在韧性性能方面表现出优异的表现，与其他组相比，上调了2-3倍。因此，添加Ca²⁺在水凝胶内形成离子交联以及在修饰nHA后进一步稳定水凝胶结构可以显着改善复合水凝胶的机械性能，这对于设计和制备满足颌面机械要求的生物材料至关重要骨修复。

图2. A)凝胶化前后制备的复合水凝胶的外观。B)HA-30在不同形状模具中的适应性。C)附着在关节上的HA-30的柔韧性。D）复合水凝胶的粘弹性行为。E) 复合水凝胶在37℃下的稀释剪切行为，以及可注射物体的照片（以HA-30为例）。F)HA-30在37℃下的交替应变扫描。G)HA-30宏观自愈特性的照片。

图3. A)HA-30 对塑料、玻璃、橡胶、木材和骨头的粘附照片。B) 复合水凝胶粘附在新鲜猪皮上的应力-应变曲线。C) 复合水凝胶粘附在新鲜猪皮上的最大粘附强度。D) 复合水凝胶的压缩应力-应变曲线。E) 复合水凝胶在 5-15% 应变下的压缩模量。F) 复合水凝胶的拉伸应力-应变曲线。G)复合水凝胶的韧性。

图4探索了 nHA@ADA/Gel 水凝胶是否以及如何驱动巨噬细胞 M2 极化，他们检测了在两种不同条件下已建立的 M2 巨噬细胞相关标志物的表达。结果显示，HA-30 可以通过 HA-30 本身的直接作用或通过 BMSCs 对 HA-30 的间接影响来诱导 M2 样巨噬细胞的极化。他们推测 HA-30 对巨噬细胞的直接免疫调节功能可能部分归因于水凝胶系统中均匀分布的 nHA。通过分泌 CCL2 和 CCL4 等趋化因子，MSCs 间接诱导巨噬细胞募集到再生部位。同时，BMSCs 通过 iNOS 和 COX2 依赖性信号通路对 M2 样巨噬细胞的表型转移发挥免疫调节功能。图5尝试确定水凝胶衍生的 M2 巨噬细胞对 BMSC 成骨分化的影响。结果显示，极化的 M2 巨噬细胞通过 CCL2、CXCL8 和 SDF-1 有助于将 BMSCs 和骨祖细胞募集到缺损区域，并促进 BMSCs 介导的骨形成通过分泌信号因子来处理和增强基质矿化。总之，复合水凝胶可作为巨噬细胞和骨髓间充质干细胞之间有效串扰的交互平台。BMSCs 的促极化作用和巨噬细胞对 nHA@ADA/Gel 的促成骨作用共同形成正反馈回路，从而加速骨再生过程。

图4. A）复合水凝胶直接诱导巨噬细胞抗炎分化的过程示意图。B)在水凝胶上直接培养的THP-1细胞中用CD206（红色）进行免疫荧光染色的共聚焦显微镜图像（比例尺=10μm）。C) 直接在水凝胶上培养的THP-1细胞中CD206的相对平均荧光强度。D、E和F)相关IL12A、TGFβ和CCL2的RT-qPCR结果直接在水凝胶上培养的THP-1细胞中的mRNA表达水平。G)在水凝胶上培养的h-BMSCs间接诱导巨噬细胞抗炎分化的过程示意图。H) 在水凝胶上培养的h-BMSCs间接诱导的THP-1细胞中用CD206进行免疫荧光染色的共聚焦显微镜图像（比例尺 = 10 μm）。I) 在水凝胶上培养的 h-BMSCs 间接诱导的THP-1细胞中 CD206 的相对平均荧光强度。J、K和L)在水凝胶上培养的h-BMSCs间接诱导的THP-1细胞中CCR2、TGFβ和CCR5 mRNA表达的 RT-qPCR结果。*p<0.05,**p< 0.01, *** p< 0.001,****p<0.0001。

图5. A) 在复合水凝胶上培养的 THP-1 细胞诱导 h-BMSCs 成骨分化的过程示意图。B) 7 天后的 ALP 染色结果（比例尺 = 50 μm）。C 和 D) 第 7 天不同条件下 h-BMSCs 表达的骨相关标志物的免疫染色。COL1（绿色）、RUNX2（绿色）和 DAPI（蓝色）（比例尺 = 10 μm）。E 和 F) ImageJ 软件对 COL1 和 RUNX2 的相对平均荧光强度分析。G、H、I、J) 骨相关基因包括OSX、RUNX2、OPN和COL1的表达。*p< 0.05，**p< 0.01，***p< 0.001 和 ****p< 0.0001。

图6为了验证 nHA@ADA-Gel 在诱导新骨形成中的作用，他们使用 SD 大鼠颅骨缺损模型评估了复合水凝胶的体内骨再生潜力。结果表明 HA-30 作为体内骨再生的生物活性候选物表现良好。结合体外结果，他们共同证明了nHA@ADA/Gel可以通过提供一个相互调节巨噬细胞和BMSCs的平台来加速新骨的形成。以往的研究已经观察到不同类型的nHA负载生物材料的直接成骨作用，其生物学功能主要归因于nHA本身和Ca²⁺的缓慢释放。在这里，他们观察到修饰nHA后水凝胶表面的特殊形态重塑，它作为生物活性交互平台通过巨噬细胞/间充质干细胞串扰进行有效骨修复。

图6. A) 颅骨标本的图像。红色圆圈表示新骨骼和宿主骨骼之间的边界。B) 颅骨标本的 H&E 染色（比例尺 = 500 μm 和 125 μm）。C、D 和 E) 修复缺陷区域中 COL1（绿色）、RUNX2（绿色）和 CD68+（绿色）CD206+（红色）巨噬细胞的免疫荧光染色（比例尺 = 40 μm 和 20 μm）。F 和 G) 骨体积/总体积 (BV/TV) 和小梁数 (Tb.N) 的形态计量分析。* p  < 0.05，** p  < 0.01，*** p  < 0.001 和 **** p < 0.0001。H、I 和 J) 注射复合水凝胶后 6 周颅骨缺损内骨再生的代表性 CT 图像。黄色三角形表示新生骨。黄色圆圈表示新骨骼和宿主骨骼之间的边界。

综合可见，华中科技大学协和口腔医院陈莉莉教授和武汉理工大学化学化工与生命科学学院樊李红教授展示了在新型 nHA@ADA-Gel 中同时增强物理特征和生物活性效应。双交联策略赋予水凝胶优异的可注射性、自愈性和形状适应性，是修复面部不规则骨缺损所必需的。nHA的修饰不仅有助于水凝胶增强机械性能，而且促进表面外观重塑为尺寸受限的多孔表面，适用于巨噬细胞和骨髓间充质干细胞之间的有效串扰和随后的成骨。这里提出的nHA@ADA-Gel成功地整合了成骨的固有特征和生物活性功能，因此为开发专门用于修复颌面部骨缺损的新型生物材料提供了广阔的机会。

该研究成果以“nHA-loaded gelatin/alginate hydrogel with combined physical and bioactive features for maxillofacial bone repair”为题，发表于Carbohydrate Polymers，2022，298，120127（DIO: 10.1016/j.carbpol.2022.120127）。武汉理工大学化学化工与生命科学学院硕士研究生周小虎为论文第一作者，华中科技大学协和口腔医院博士研究生孙纪威和硕士研究生沃珂琪为论文共同第一作者，中科技大学协和口腔医院陈莉莉教授和武汉理工大学化学化工与生命科学学院褚莹莹讲师、樊李红教授为论文共同通讯作者。

论文链接：

https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2022.120127

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