继12连发，SLAF-遗传图谱再创佳绩（文末有福利~）
2018年，图谱君刚感受到春的气息，百迈客遗传群体功能基因定位的文章就“科池科池”的大波收割了，为奋斗在科研前沿的您点个赞。SLAF-seq 也是收获满满，如：利用SLAF-BSA技术，分别在《Scientific Reports》和《Plant Journal》上发表了小麦抗条锈病基因及黄瓜耐涝基因定位的相关研究。除此之外，SLAF-遗传图谱也厚积薄发，1月，海胆遗传图谱在线发表于《Scientific Reports》；3月，由百迈客和中国科学院植物研究所宋献军教授合作的“TGW3, a major QTL that negatively modulates grain length and weight in rice”（IF=8.8，2018.3）发表于知名杂志Molecular Plant ，具体研究如下：
-背景-
水稻是草本稻属的一种，也是稻属中作为粮食作物最主要最悠久的一种，其产量与人们的生活息息相关，粒长和粒重是影响其产量的关键因素。目前，克隆到的影响水稻的粒长和粒重的基因有 GS3，GL3.1 ，TGW6，GW7，GLW7等。本文克隆到了一个新基因TGW3，它通过影响细胞伸长及分裂进而调控水稻粒长和粒重。
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材料与方法
亲本：JZ1560（大粒）×HHZ（小粒）
群体：F7 RIL群体，NIL群体
测序技术：SLAF-seq
功能分析：SEM，酵母双杂交，亚细胞定位，表达谱构建，驯化分析
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结果与分析
1.遗传图谱构建及QTL定位
JZ1560表现为大粒性状，HHZ为小粒表型，且它们在粒宽，粒长，千粒重方面表现出显著差异（图1）。为克隆影响籽粒性状的相关基因，作者利用JZ1560和HHZ杂交而来的F7 RIL群体，进行QTL定位。首先，在考察相关性状符合正态分布后，采用SLAF-seq技术对RIL群体进行基因分型，最终获得了18194个高质量的SLAF标签构建遗传图谱，结合2015和2016两年谷粒长度（GL），谷粒宽度（GW），千粒重（TGW）和GY（单株产量）的表型数据，共找到40多个QTL位点与产量性状相关，其中包括了已发表的基因GW2和GW5。91％ 与GL，GW和TGW 相关QTLs可以被重复检测到，而对于GY 性状的QTL，重复检测率约42％。为了验证QTL定位结果，采用了PCR基因分型和QTL分析，发现大多数已报到的效应较大的QTL可以被重复检测到，而JZ1560中存在一些新的主效QTLs，如qGL1-1，qGL3 / qTGW3-2（下文中的qTGW3）影响籽粒大小，重量和产量。
图1 亲本表型及农艺性状考察
2.qTGW3基因定位
接下来作者重点关注了qTGW3基因座, 构建其对应的近等基因系（NIL），在qTGW3连锁标记JD3014和JD3015标记之间渗入JZ1560的基因片段，与HHZ同基因对照相比，GL增长7.6％，GT和GW的增幅相对较小，分别是4.2％和1.1％，TGW出现了8.5％的增长，这说明TGW3主要通过GL的增加来提高千粒重。
通过对JD3014和JD3015标记间的54个重组单株分析，将qTGW3定位于3号染色体18.7kb的区域内，其中有3个候选基因。这些ORF中，LOC_Os03g62500编码GSK3 / SHAGGY类激酶，而水稻中有已报道的GSK3 / SHAGGY类激酶GSK2在调控籽粒大小方面发挥重要作用，推测LOC_Os03g62500为最有可能的候选基因。对其序列分析表明，与HHZ中LOC_Os03g62500等位基因相比，JZ1560等位基因的外显子3和4缺失，此区域为ATP结合位点（ABS）结构域，揭示了JZ1560可能由于LOC_Os03g62500功能的丧失，出现了籽粒较大的表型。
图2 TGW3基因定位
3.转基因验证
应用转基因技术，验证TGW3基因功能，超表达 HHZ材料中的LOC_Os03g62500等位基因，S14,S16出现粒长减小的表型，下调 HHZ中等位基因的内源表达，AS87，AS88出现粒长增加的表型。另外在CRISPR / Cas9植株中，粒长增加。这说明LOC_Os03g62500为TGW3，调控着籽粒长度。
图3 转基因材料表型
4.TGW3功能分析
为揭示TGW3调控籽粒大小的分子基础，使用RT-PCR构建它的时间和空间表达谱，结果显示该基因幼穗中表达较高，这与它生物学功能相一致。同时，TGW3连接绿色荧光蛋白（GFP）标记瞬时转化烟草叶表皮细胞，融合蛋白定位至细胞核和细胞质。SWISS-MODEL数据库分析表明，JZ1560等位基因的cDNA序列中发现了两个核苷酸取代（TGW3JZ），其不引起任何氨基酸改变和333-bp片段缺失（相当于111个氨基酸残基），该缺失导致ABS结构域的完全丧失和对二聚体结构域的破坏。酵母双杂交实验结果表明HHZ中TGW3等位基因可以在酵母细胞中与自身互作。
为揭示TGW3调控籽粒大小的细胞学机制，作者通过对成熟阶段外稃中心部分细胞扫描电镜观察，与对照相比， NIL（TGW3）细胞宽度没有差异，但细胞体积变大（约10.1％），长度增长（10.6％，在籽粒长度方向），但是总细胞数量显着下降。TGW3转基因材料中，下调TGW3表达和CRIPR-Cas9材料中，外稃细胞体积增大，而过表达TGW3植株中细胞体积明显减少。推测TGW3通过影响细胞增大及细胞分裂调节籽粒大小。为了研究TGW3是否与驯化相关，在1529个种质中对其进行了分析，TGW3基因座的100kb区域未检测到任何驯化信号。
总之，本文SLAF-seq技术，构建出水稻高密度遗传图谱，并定位到40多个控制籽粒性状的QTL位点。并利用图位克隆的方法，定位到影响粒长及粒重的基因TGW3。TGW3通过影响细胞大小及细胞分裂，负调控籽粒大小。此项研究告诉我们超大米粒的遗传结构，揭示了一种新的粒型调控机制。
- 参考文献 -
JieZheng Y, Ming M, Chen B,et al. TGW3, a Major QTL that Negatively Modulates Grain Length and Weight in Rice [J]. Molecular Plant，2018
遗传群体事业部 胡思帆 | 文案
许语辉 | 审核
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