英文题目：Do the toll-like receptors and complement systems play equally important roles in freshwater adapted Dolly Varden char(Salvelinus malma)?
杂志：Fish Shellfish Immunol.
影响因子：3.185
接收时间：2018.09.24
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百迈客全长转录组成功案例第7篇-水产篇
最近百迈客可谓喜事连连，10月8日福建农林大学基因组研究中心与百迈客合作的甘蔗基因组发表在Nature Genetics，激动的心情尚未平复，全长转录组也来凑热闹了，嗯，你们听得没错，百迈客第7篇成功案例出炉了，2018年9月25日宁波大学海洋学院，黎明老师课题组“Do the toll-like receptors and complement systems play equally important roles in freshwater adapted Dolly Varden char (Salvelinusmalma)?”研究成果已被 Fish Shellfish Immunol.接收。
目前国内全长转录组发表十几篇左右，百迈客真真占了大半江山，稳居国内全长转录组成功案例最多的公司，强调一下，没有“之一”，该项目2017年4月结题，2018年9月24文章接收，经过一年左右时间进行数据整理、分析和验证，非常高效，充分体现了三代全长转录组技术新、更易、更快发文章特点，还在犹豫是否做全长转录组的科研大咖，人家可正憋着写全长转录组文章呢，看了这篇文章就别纠结了，不然真不赶趟了，闲话不说，直接上干货，看一下发表无参全长转录组文章之套路吧！
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研究背景
花羔红点鲑是溯河产卵鱼类，在泛太平洋分布。中国东北部山区河流中的花羔红点鲑终身生活在淡水中。早期研究主要集中于花羔红点鲑的生长和地理分布，而对于淡水花羔红点鲑抗细菌感染的免疫系统的影响知之甚少为了探讨花羔红点鲑适应淡水对其免疫系统的影响，特别是补体系统（complement system）和Toll-like受体（toll-like receptors，TLR）途径的影响，本文对细菌侵染的中国淡水花羔红点鲑进行全长转录组研究。
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材料和方法
材料：中国通化市鸭绿江上游支流取鱼（184.6±23.4g），将鱼随机分为两组，腹腔注射嗜水气单胞菌或相应体积的0.9%盐水。
全长转录组测序：从细菌注射24h组处死3条鱼，收集肝脏和脾脏组织等量混合构建全长转录组文库；
测序平台：北京百迈客生物科技有限公司PacBio RS II 测序平台，构建3个文库，0-2kb，2-3 kb和3-6 kb。
qPCR验证：细菌注射后0h、6h、12h、24h、36h、48h、72h、96h各处死3条鱼，将肝脏和脾脏组织立即液氮速冻，保存-80℃；
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研究结果
1、cDNA文库特征
以中国淡水花羔红点鲑为材料，将细菌注射鱼腹腔法，取肝脏和脾脏等量混样构建cDNA文库测序。去除接头序列和低质量序列（＜50 bp）之后，产生了超过14.88GB clean data，总数为7,728,364。0-2kb，2-3 kb和3-6 kb分别产生4,565,697、2,087,033和1,075,634 clean data。经过质量控制、数据过滤和去除冗余后，采用31233个高质量转录本获得27,829个转录本。共鉴定出24,541个开放阅读框（ORF），其中17,670个是完整的。
2、转录本的功能注释和分类
对27,829个转录本进行数据库功能富集和分类注释分析，25,809个转录本被注释。NCBI-Nr数据库比对显示，转录本匹配到一系列物种（见图1）。Nr数据库中比对上转录本共有25,653个(92.18%)，52.04% 转录本与虹鳟（Oncorhynchus mykiss）相似，其次是大西洋鲑（Salmo salar）(23.53%)和梭子鱼（Esox lucius）(14.01%)，其余匹配的物种不到10%。
GO数据库注释16,612个（59.69%）转录本，富集到两个与免疫相关的亚类，分别是“响应刺激”（3,124个转录本）和“免疫系统过程”（851个转录本）（图2）。将转录本与KEGG数据库比对，共有16917个转录本富集到271个通路。免疫相关的KEGG通路主要包括细胞因子-细胞因子受体相互作用（106个基因）、Toll样受体信号通路（51个基因）、IgA产生的肠道免疫网络（20个基因）等。
图1 中国花羔红点鲑肝脾cDNA文库Nr注释同源种分布
图2 转录本GO分类
3、免疫相关基因验证和鉴定
重新测序验证了中国原生淡水花羔红点鲑C4基因（S.m-C4）的完整ORF，长度为5160bp，编码具有1719个氨基酸(aa)残基的蛋白质。通过两两氨基酸序列比较结果显示，Salmo salar与中国花羔红点鲑的同源性最高(94.4%)，相似度最高(88.3%)。
确认了中国原生淡水花羔红点鲑TLR5基因(S.m-TLR5)的cDNA序列。长度为3123 bp，包括207-bp 5’非翻译区域(UTR)， 3’-UTR长度为279 bp，开放阅读框(ORF) 2640 bp编码879个氨基酸(见图4)，S.m-TLR5蛋白理论分子量为100.6 kDa。
图4 S.M－TLR5的核苷酸和预测的氨基酸序列
4、多重序列比对
多重序列比对表明，硬骨鱼和人的氨基酸高度保守。推导出的S.m-C4蛋白具有α-β连接子序列RXXR(在残基668-671)和α-γ。连接序列RRXR（残基1426-1429），其中C4氨基酸链被切割成三个链（α，β和γ链）。此外，保守的硫酯（GCGEQ）位点也定位在残基1001至1005（见图5）。预测了TLR5由前21个氨基酸组成的信号肽和由14个氨基酸组成的跨膜螺旋。在膜结合型TLR5的LRR-CT中发现4个保守的半胱氨酸残基，此外，还有9个蛋白结合区。结果表明，S.m-TLR5蛋白与银大麻哈鱼（91.5％）、大西洋鲑（91.7％）和衰白鲑（89.6％）的同源性较高，与鲤鱼（48.1％）和金鲫（48.8％）的同源性较低。
图5 中国淡水花羔红点鲑与其它物种C4氨基酸序列的多重比对
5、重建系统发育
为了探究S.m-C4和S.m-TLR5免疫基因在鱼类体内的系统发育情况，中国淡水花羔红点鲑与另外23条硬骨鱼、两条鲨鱼和一条腔棘鱼用于C4基因研究。重建贝叶斯系统发育中，四种鲑鱼形鱼类组合在一起，具有较高的后验概率（PP）(图7)。同时三种鲤形目鱼类和两种鳃形目鱼类分别用1.00PP进行分组，形成骨鳔总目分支。这一结果与传统分类学和系统发育相一致。硬骨鱼分为鳃形目、原鳃形目、鳃形目和棘鳃目四支，其中，两条鲨鱼是外群。
图7 重建C4基因贝叶斯系统发育
6、分子进化分析
首先，利用位点模型探讨C4基因中是否存在因其不同的分类地位和生存环境而正向选择的位点。在模型中，只有M1a-M2a和M7-M8能够检测到正向选择位点。M7-M8检测到PP > 0.95的10个正向选择位点，其中9个位点也被M1a-M2a检测到，表明鱼C4基因的正向选择。其次，利用分枝模型来探究这些正向选择事件是否发生在特定的鱼类谱系上，从而导致现在的鱼或者祖先鱼类。最后，利用分枝位点模型，在特定的现在和祖先谱系中检测了这些位点。对于C6基因，M7-M8在正选择压力下仅检测到一个位点，而花羔红点斑鲑或其他冷水鱼中的分支位点未检测到任何正选择位点（表8）。
7、qPCR验证相对表达量
为探讨这两种免疫基因在细菌侵入的免疫应答，采用定量实时PCR（qPCR）技术，观察注射后96h内肝、脾脏相关基因的表达。对于盐水处理组，即对照组，S.m-C4基因在研究的所有时间点肝脏中均无显著差异（图9A）。对于嗜水气单胞菌注射组，即实验组，肝脏在24小时有显著增加（p=0.04），在12小时和72小时出现两个峰值，边缘显著。在6h、12h、24h和72h，实验组与对照组有显著性差异。对照组脾脏中S.m-C4基因的相对表达上下波动，8个时间点之间差异不显著，实验组脾脏中S.m-C4基因的相对表达除72h外，其余时间点均无差异，与细菌注射组0 h相比减少59.6%（图9B）。
图9 嗜水气单胞菌或盐作用肝脏中S.m-C4相对表达量
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结论
1、本研究以细菌侵染后中国淡水花羔红点斑鲑为材料，构建了全长转录组文库。经过质量控制，从31,233个高质量转录本中共获得27,829个转录本，并鉴定出24,541个开放阅读框（ORF），其中17,670个完整。
2、将27,829个转录本用于功能富集和分类分析，25,809个转录本得到注释。相对于适应免疫基因，注释到更多先天免疫相关基因。参与Toll-like受体信号通路的基因多于补体和凝血级联，表明Toll-like受体在细菌侵染的淡水花羔红点鲑中发挥更重要的免疫作用。
3、为验证全长转录组鉴定基因序列准确性，选择S.m-C4和S.m-TLR5进行重新测序验证，进一步证明测序结果的准确性。
4、中国淡水花羔红点鲑中TLR和补体系统显著数量差异，可能是TLR和补体系统进化压力模式的不同所致，以TLR3和TLR5以及C4和C6为代表，它们分别处于纯化选择和正选择压力。
PacBio 与 Nanopore 均属于第三代测序技术，拥有超长读长的优势，均可获得全长转录本序列：PacBio测序平台打破了二代读长短、GC偏好性的壁垒，其平均读长更长、数据准确度更高、分析结果更准确，局限在于不能对转录本定量分析，需要二代测序辅助定量；而 Nanopore 最大读长更长，同时既可以对转录本定性，又可以对转录本定量，不需辅助二代，成本低，可以说是科研界的新宠。
北京百迈客生物科技有限公司于2015年率先引进三代测序平台PacBio RSⅡ和PacBio Sequel，至今已积累了丰富的项目经验，目前已成功发表7篇文献，是国内发表全长转录组成功案例最多的公司，已发表文章研究物种分别有杨树、甘薯、野生甘薯、兔子、跳甲、辣椒和花羔红点鲑，覆盖领域分别为林木、哺乳动物、昆虫、作物和水产等。2018年8月份牛津纳米孔公司与百迈客公司达成长期合作，已引入Oxford Nanopore平台，拥有 MinION、GridION X5 和 PromethION 三种型号全套纳米孔测序仪。
Pacbio和Nanopore测序平台各有所长，科研工作者可以根据自己的需求选择不同的平台。百迈客将竭诚为您服务，全长转录组研究的物种不断丰富中，期待广大科研爱好者的精诚合作，谱写更丰富的三代测序成果！
猜猜百迈客全长转录组下一个成功案例会是什么物种呢？和小编一起期待一下吧！
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