提起微生物多样性测序，大家第一反应可能就是PE250或PE300二代测序，but这只能针对细菌16S rDNA和真菌ITS的某一段可变区（如16S V3+V4，16S V4+V5，16SV4，ITS1，ITS2等）进行测序。显而易见的问题就是读长短。随着三代测序兴起， PacBio 测序平台，利用单分子实时测序（SMRT Cell）的方法，选择 CCS（Circular Consensus Sequencing）模式测序，最保守的Reads平均读长8-15kb。细菌16S全长约1.5Kb，假设最短的一条Reads 8Kb，也可以满足一条1.5Kb的16S全长纠错5次，minPasses≥5，据官方数据，同一片段测序 4 次后，单一Read的准确性至少可达99%。对于微生物多样性测序，三代测序比二代测序优势显而易见：测通，且准确。案例分析来了：
Superior resolution characterisation of microbial diversity in anaerobic digesters using full-length 16S rRNA gene amplicon sequencing
使用全长16S rRNA基因扩增子测序技术对厌氧消化池中的微生物多样性进行高分辨率表征
IF：7.913，Water Research，2020
厌氧消化池（AD）能够将特定微生物群落介导的各种有机化合物转化为甲烷，以进行一系列生物反应。通常，微生物群落可分为发酵细菌，互营细菌和产甲烷古细菌。通常使用Illumina平台通过16S rRNA基因分析来确定参与互营代谢的微生物群落。之前的研究使用Illumina平台揭示了90个不同的全规模厌氧消化池中的微生物群落结构，并表明AD微生物群的组成是由操作驱动的。但是，Illumina测序方法的两个主要缺点（读长短，低拷贝数）限制了其在系统分类中的分辨能力。为了更好的分辨AD中微生物组成，基于全长16S rRNA基因序列，使用PacBio单分子实时（SMRT）测序方法，实现精确到种的鉴定。从5个国家，不同规模的市政污水处理厂收集了19个厌氧消化池污泥DNA样本。1、样品中大多数的古细菌属于广古细菌门，检测到了四个目；大多数OTU被分配到具有代表性可培养菌株的14个不同的属中。其中，甲烷丝菌属，甲烷绳菌属和甲烷八叠球菌属丰度最高。在高丰度的菌株中发现与两个候选属（即Ca. Methanogranum和Ca. Methanoplasma）有关的序列，两者都属于甲烷单胞菌科，但尚未被分离得到；在种水平鉴定出十六种产甲烷古菌。2、对35个相对丰度> 1％的古生细菌OTU进行种水平鉴定（图1）。在高盐度消化池中鉴定出Methanosarcina horonobensis，占古细菌种群的72.51％。在高温消化池中发现Methanosarcina flavescens是丰度最高的物种（27.96％）。在所有的操作条件下，消化池中均存在能分解乙酸的Methanothrix concilii，平均丰度为18.63％，除了高温消化池，占所有消化池中甲烷丝菌属一半。
Fig. 1. The relative abundance of OTUs phylogenetically related to methanogens at a relative abundance >1% at the species level. Sequence identity was determined by using BLAST against the SILVA 132 Reference database. 3、在变形菌门中， mesophilic Smithella是最丰富的属，在预处理，消化池工作于<30 ℃，~40 ℃和中温条件下，占互营细菌菌群总数的38.3~47.5％。在各种条件下检测到史密斯氏菌属中的六个未培养谱系，超过90％的与史密斯拉相关的OTU与与降解烷烃的史密氏菌菌株D17和M82密切相关，只有一个与丙酸史密氏菌相关。 4、使用LEfSe分析来表征特定操作条件的AD微生物组(图2)，显示Clostridia的不同群体在高温消化池中的作用更大。进行了co-occurrence network网络图分析作为补充（图3），以探索发酵菌和互营细菌之间的关系。
Fig. 2. The taxonomic difference among different operating conditions evaluated using LEfSe. Panel shows a cladogram illustrating the statistically significant taxa in different operating conditions.
Fig. 3. Four subnetworks were extracted from the network constructed using CoNet, clustered by CytoCluster, and visualised via Cytoscape. Each node denotes an OTU at 99% sequence similarity.
5、在多样性分析和系统分类中，对PacBio Sequel的细菌长读长测序结果与Illumina 的短读长测序（v4-v5）结果进行了比较，得到的结果如下：（1）alpha和beta多样性的差异很小。对于alpha多样性，虽然长度长的覆盖度数值较低，但香农多样性指数值略高于短读长测序结果。可增加测序数据的数据输出来提高长读长测序方法的覆盖度。因此，长读长测序方法可以提供与短读长测序等效的足够的覆盖度。两种读长测序结果的β多样性均显示相似的聚类。（2）在相对丰度> 2％的OTU内，长度长测序结果中观察到了15个其他的OTU，鉴定了一些被忽略的产甲烷菌。需要进一步关注以了解其在AD中的作用。（3）短读长测序低估了某些门，例如，在相同的样品中，短读长测序结果中的Ca. Patescribacteria组成为0.34至2.75％，而在长读长测序结果中为20.96至42.87％。（4）在高温消化池中，短读长测序结果中的嗜热菌比长读长测序多15.03~27.55％，而长读长测序结果中检测到多2.98 ~ 8.24％的Ca. Coprothermobacteraeota。（5）发现了短读长测序结果中的错误分类。例如，在长读长测序结果中Ca. Coprothermobacter属来自Ca. Coprothermobacteraeota门，而在短读长测序中被错误的分类为来自嗜热门的Fervidobacterium属。这可能是由于这两个属在系统发育的位置上被描述为“姐妹”，导致了分类学上的差异。有学者也报道了使用V4区域扩增子Fervidobacterium的过度表达。两者在生理特性上不同，且都是第二大丰度的OTU，这可能导致对微生物成分和消化池性能的不正确解释。可能需要外部验证来确定用于这种观察的两种测序方法的准确性。这项研究证明了使用PacBio Sequel平台进行全长16S rRNA扩增子测序，是解决低质量的环境DNA样品的方法。测序结果为鉴定菌种提供了更高的分辨能力，有助于分辨厌氧消化池中微生物的组成。文中重点描述的产甲烷菌种，即Methanosarcina horonobensis, Methanosarcina flavescens，在不同的消化池中占主导地位，体现了全长16S rRNA扩增子测序检测精确到种水平。通过基因组数据库的扩展以及测序方法和化学方法的改进，全长测序在混合培养环境和工程样品中的应用将更具前景。结合这个案例分析，大家对于自己测序计划选择哪个平台，心中应该有答案。按照惯例，我们推三代全长微生物多样性怎么可以没有活动呢？做全长微生物多样性送分子实验火热进行中
一次送样达18个样本，送百迈客PCR试剂盒；样本数加倍，赠送试剂数量加倍，以此类推。老师可使用百迈客PCR试剂盒对测序后环境样本中分离的单菌进行基因克隆，获得功能基因或16S、18S、ITS序列，进行后续的实验。老师也可以换取同等价值百迈客其他分子试剂盒。上期来看一夏Nanopore测序里面图表，写的有点歧义，更正一下：
PacBio和ONT Pc共同鉴定到已知基因个数为13,967个，PacBio和ONT Pc分别单独鉴定到1283和2542个已知基因。
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