单细胞测序解析糖尿病肾病中肾小球的动态变化

Background：在介绍这篇文章的具体研究内容之前，我们有必要用一定的篇幅来详细介绍一下单细胞测序（Single-Cell RNA sequencing）这一新兴技术。单细胞测序可以看作传统转录组测序（RNA-seq）的升级版（这也导致了现在有凡是有关单细胞测序的文章，必然会在Introduction里狠踩一脚RNA-seq，称之为bulk RNA-seq）。传统的RNA-seq研究对象为整个组织或者细胞团，分辨率比较模糊，这一测序方法的漏洞便是默认了整个组织中所有细胞表达模式均是一样的。而具有生物学背景的人都清楚，组织内的细胞之间是有异质性的，这是在最初分化时就决定了的，注定了不同种类的细胞之间表达模式具有特定差别。而大家多年来使用RNA-seq无非也是对现有技术的“妥协”。曾经也有过使用流式细胞术分选特定细胞后对特定细胞测序的方法，虽然也能够实现对目的细胞的测序，但是显然这样的方法更繁琐、更不经济，且只能对已有成熟分选方法的细胞进行建库，低效且不智能。

相较于上述两种方法，单细胞测序则能对多细胞系统进行深度更大、分辨率更高的分析。其基本流程如下图所示，首先制备样本细胞的悬液，在细胞计数、统计细胞存活率合格后（>80%）使用微流控技术处理单细胞悬液 ，使单个细胞与带有cell barcode（独一无二的标签序列，下游生信分析时通过barcode来讲序列注释回原细胞）的bead一同被油滴包裹形成Single Cell GEMs（Gel Bead-in-Emulsions）体系后。形成的每个乳滴可以独立完成RT-PCR。RT-PCR完成后破乳获得核酸，此后的测序工作几乎与传统RNA-seq无异。数据下机后，通过barcode的注释，可以将每条序列注释到原先的细胞之中，实现对特定细胞类群、特定细胞的数据分析，填补Bulk RNA-seq的漏洞，充分考虑细胞间的异质性。

回归到这篇文章，作者分离肾小球组织制样进行单细胞测序，从而对肾小球中的几种细胞（glomerular endothelial cells、mesangial cells、podocytes、immune cells、tubular cells）进行了有目的的分析。这里作者也对前人的工作做了一下点评：此前对正常肾脏的单细胞测序结果显示，捕获到的细胞中80%都是proximal 与collecting tubule origin，相比之下glomerular就少得多。另外，在狼疮肾炎（lupus nephritis）、肾癌、肾移植等研究中，单细胞测序最多也只能捕获到19种细胞，（而MCA数据库中记载的肾脏细胞一共有29种），这也导致了此前的研究都无法从全局解析肾小球（总是有一部分细胞无法捕获），也就是说简单的对肾皮质样本的研究无法对肾小球做出高分辨率的解析。而肾小球的在糖尿病肾病的早期发病过程中起到了重要作用。为了避免这一局限性，作者将肾小球组织从肾脏中分离出来用于单细胞测序的建库。

Methods：(简单的罗列一些要素）

1、动物实验：作者使用STZ对eNOS（eNOS为APN信号传导过程中AMPK的下游分子，在高糖环境下表达水平下降，与T2D的发病相关）敲除的C57BL/6小鼠（这种动物模型可以在糖尿病的后期表现出肾小球的损伤）进行造模，使用柠檬酸盐作为control组，在喂养期间每2周收集一次尿液用于下游分析。

2、各项检测：除了单细胞测序之外，作者为了对疾病进程进行评估，对肾脏部位进行了组织学分析，利用收集到的尿液进行了白蛋白、尿肌酐水平的检测。

3、单细胞测序：上文已经提过，作者为了对肾小球做出分辨率更高的分析，特意分离出肾小球组织用于下游的测序，此后的方法与常规的单细胞测序无异。

RESULTS:

1、单细胞测序：

（1）细胞类群与cell marker：此次测序一共捕获了829个单细胞（403个来自control组，426个来自糖尿病组），QC过滤后剩下644 个细胞（326个来自control组，318个来自糖尿病组）。平均每个细胞中包含了3457个基因（control组平均为3417，糖尿病组平均为3509）。利用Seurat的tSNE算法得到的细胞聚类投影图如下图所示，共得到了五个cluster——Immune cells（IC）、Tubular cells（TC）、Podocytes（Pod）、Mesangial cells（MC）、Endothelial cells。

分离出5种cluster后，作者针对每种cluster挑选出其中在control组与糖尿病组中表达模式一致的差异基因，并绘制了这些基因的热图。可以初步认为这些基因都是有细胞特异性的，并有望成为这些细胞类群的cell marker。作者进一步挑选了有显著差异的基因绘制了小提琴图，为cell marker的确定提供参考。

（2）细胞分布的变化：据以前报道，正常小鼠肾脏中各细胞的比例大约为37%GECs、36%MC、27%Pod；而这篇文章中control组的各细胞比例为49%GECs、32%MC、15%Pod、IC1.5%；糖尿病组的各细胞比例为GECs65%、IC15%、MC12%、Pod5%、TC2%（TC在两组之间并无显著差异）。这些变化也很好解释，数量增多的细胞多是由肾小球肥大与系膜扩张引起的，数量降低的则是遭受组织损伤带来的破坏，免疫细胞比例的大大上升也揭示着糖尿病肾病带来的损伤可能与炎症反应息息相关。（当然，这些数据的差异也可能是由不同的单细胞制备方法导致的，在解离的过程中细胞的应激反应不可避免，而不同类型的细胞对应激反应的敏感程度自然也不同）

（3）巨噬细胞：我们刚刚提过，免疫细胞的数量在糖尿病肾病的肾中大大增加，因此对这些细胞具体类群的解析尤为重要。在统计了基因在各个细胞中表达情况后发现macrophage的marker基因如C1qa、Cd74、Adgre1在这些免疫细胞中呈高表达，而其他免疫细胞如嗜中性粒细胞、B cell的cell marker仅在少数细胞中表达。此外，所捕获的macrophage以M1为主。

（4）差异表达基因：为了解析糖尿病与正常control组之间的肾小球基因表达差异状况，作者分别对不同细胞类群基因表达做了对比（由于该实验捕获到的总细胞数较少，实际在分析时仅考虑了endothelial和mesangial cells）。结果如下图所示，血管生成与迁移通路在endothelial细胞间有显著的变化（这与此前的bulk RNA-seq结果相一致）。mesangial cells之中，与翻译调控、基因表达、蛋白质稳定化的相关通路在糖尿病组内得到富集。

考虑到可能存在一些基因，其表达模式仅在损伤发生的过程中发生暂时的变化，从而在最终的差异分析中被忽略，作者采取了拟时序轨迹分析（pseudotime trajectory）的方法处理了endothelial和mesangial 的数据，希望能够揭示从control状态向糖尿病肾病状态改变的动态过程，结果如下图所示。可以发现，随着pseudotime的推移，control细胞确实沿着特定的轨迹向糖尿病样本的细胞转变。

除了对细胞状态的评估，作者对6个cluster的前1000个差异基因进行了拟时序分析，结果如下图所示。从图中我们可以清晰的看到，所挑选出的差异基因均在糖尿病肾病发展的过程中发生了某种特定的变化，这些变化是单向的、与疾病发展过程相一致的。换句话说，这些基因都是糖尿病肾病潜在的marker或治疗靶点。其中leucine-rich α-2-glycoprotein1（Lrg1）在糖尿病鼠的GECs中表达上调，这与此前bulk RNA-seq的结果相一致（这可能是由于endothelial的细胞数量众多导致的），这也证明了该基因在糖尿病早期的内皮损伤过程中起一定的作用。此外作者还提到了分析膜受体与配体基因之间的表达关系，试图解释细胞之间的信号交流，可惜未果。

Discussion：

1、不足：最明显的一点不足便是由于此实验设计为了追求对于肾小球细胞的详尽解析，选择了分离出肾小球组织再进行单细胞测序的实验方案，虽然这样大大提升了数据的分辨率，减少了其他细胞带来的噪音，但这也大大降低了样本中的细胞数量。最重要的是导致了许多细胞的下游分析无法进行。不仅如此，虽然endothelial和mesangial满足细胞聚类与差异基因分析的条件，但是由于其细胞数量较低，从而导致偶然误差与背景噪音带来的影响会非常大。此外作者在Method里提到了免疫组化的实验，然而结果中并没有展示出来。最重要的是这篇文章的内容基本就只有造模与单细胞测序这两个模块，没有涉及到下游对测序结果的验证

2、发现：

（1）此次单细胞测序的结果与该团队此前的bulk RNA-seq结果中的差异基因仅有10%的重叠，这也再一次证明了两种技术的差别。

（2）在control组与糖尿病组的对比之中，细胞种类的比例发生了很大程度上的变化，尤其是免疫细胞数量的大大提升揭示了炎症反应可能在糖尿病肾病的发病过程中起到关键的作用。最有意义的是，通过对细胞类群的注释确定了该炎症反应中起主导的作用的为M1细胞。当然，这些细胞数量的差异是否由细胞解离步骤引入也是一个值得深究的问题。

总之，这篇文章利用单细胞测序这一火热的技术第一次揭示了糖尿病肾病与正常小鼠肾小球的差别，也为后来者提供了强有力的参考。