文献阅读（十五）、癌前基质细胞驱动BRCA1肿瘤发生
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写在前面
这是又一篇粉丝来稿，阅读是一种习惯，让自己紧跟科技前沿，学术研究忌闭门造车。因此我们也鼓励大家多阅读、多记录，欢迎大家的来稿，我可以酌情为大家提供稿费、资料、阅读指导。
可以说是一篇优秀案例了，我几乎没有做任何改动，甚至排版的工作也节省了不少。大家可以像这篇文献分享一样，把自己的读书笔记整理的结构清晰、思路明确、并在最后附上自己的思考。当然，这篇分享翻译感过重，大家不要模仿doi:
10.1101/2021.10.20.465221
链接：
https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2021.10.20.465221v1
Highlight
● 聚焦于瘤前状态BRCA1种系突变携带者，基质细胞对上皮细胞的细胞间通讯。
● 单细胞分析相互作用（细胞通讯）
● 在BRCA1/mut中发现了几种富含的促肿瘤生长因子，包括来自成纤维细胞的FGF2和HGF，以及来自周细胞的NGF和INHBA
● GO-term分析显示，BRCA1/mut样本显示周细胞和成纤维细胞的促增殖通路总体增加，而内皮细胞显示MAPK信号传导增加，这表明基质生态位的改变驱动了癌前乳腺组织中的上皮细胞增殖
● 细胞周期评分分析发现处于S期的BRCA1+/mut上皮细胞的百分比增加，对PCNA进行了免疫荧光染色证实BRCA1/mut（n=3）样本中PCNA阳性上皮细胞数量增加了约2倍
● BRCA1+/mut周细胞分泌的NGF促基底细胞增殖
● 流式——只有基底细胞表达NGFR
● 乳腺球形成试验，NGF的加入显著增加了基底细胞（而非腔细胞）的乳腺球的数量和大小，并增强了乳腺分支形态发生分支形态发生
● BRCA1+/mut成纤维细胞出现pre-CAF表型并分泌MMP3促BRCA1介导的肿瘤发生
● 免疫荧光——MMP3阳性基质细胞在BRCA1+/mut组织中的上皮结构附近扩张，提示在人类BRCA1+/mut中，促肿瘤MMP3与乳腺癌风险增加有直接联系
● 3D基质上皮共培养——在对照成纤维细胞中使用慢病毒MMP3过度表达（+MMP3），与仅对照GFP的成纤维细胞（GFP）相比，其显示出显著增加的生长。相反，在BRCA1/mut成纤维细胞中使用CRISPR/Cas9介导的敲除MMP3（-MMP3）可显著降低乳腺球的生长
● 小鼠实验——证明MMP3促BRCA1介导的肿瘤起始。①六周后，发现MMP3组（12/12）的肿瘤起始频率明显高于仅乳腺细胞组（4/12）和GFP对照组（8/12）。②与两个对照组相比，根据肿瘤体积和质量，显示MMP3组的肿瘤生长显著增加
● BRCA1+/mut成纤维细胞的“pre-CAF”表型
● BRCA1+/mut成纤维细胞在癌前阶段始终呈现“pre-CAF”表型
● Kaplan-Meier生存分析对1809名患者用前100个标记基因进行了队列研究，结果显示pre-CAF与预后不良的对照基因特征密切相关，强调了CAF前期人群的潜在疾病相关性。
● 成纤维细胞分泌的MMP3可以诱导上皮细胞中基底样分化改变的luminal细胞的扩张
● BRCA1+/mut基底、luminal1和luminal2上皮细胞的scEnergy显著高于对照组
● 单细胞western blot（scWB）、免疫荧光——BRCA1+/mut中KRT19/KRT14双阳性细胞的百分比增加。
● ps.管腔（KRT8、KRT19）和基底（KRT5、KRT14、KRT23）标记物
● luminal1-ALDH1A3+亚群也被发现表达高水平的KRT23
● 免疫荧光分析显示BRCA1/mut中KRT23阳性管腔细胞数量增加
● MMP3过度表达或对照（GFP）成纤维细胞共移植的肿瘤进行原位分析——基质MMP3过度表达时的KRT5/KRT8双阳性肿瘤细胞表达显著增加
● 数学模型预测
● 2倍的基质诱导的增殖增加会导致潜在癌祖细胞群的显著积累。
● 随机突变模型——增殖增加2倍会导致癌症总风险显著增加。这表明，基质细胞诱导的增殖可能与BRCA1+/mut中的祖细胞扩张和乳腺癌风险增加直接相关
● 结论：BRCA1+/mut瘤前组织中基质细胞群的改变，作用于上皮细胞，NGF促进基底细胞增殖，MMP3诱导KRT23阳性的管腔祖细胞亚群扩增，促进BRCA1介导的肿瘤发生
Abstract
● 背景
● BRCA1/mut中的癌症起始与乳腺上皮癌前病变相关，包括分化改变、增殖应激和基因组不稳定性。然而，在BRCA1驱动的肿瘤发生过程中，与上皮细胞相关的基质的作用尚不清楚
● 结论：恶性前基质促进上皮细胞增殖和BRCA1驱动的跨细胞癌发生。
● 通过对人类癌前BRCA1/mut和对照乳腺组织进行单细胞RNA序列分析，作者发现基质细胞提供大量促增殖旁分泌信号，诱导上皮细胞增殖。
● 作者确定了一个癌前相关成纤维细胞亚群（pre-CAF），该亚群产生大量促肿瘤因子，包括基质金属蛋白酶3（MMP3），并在体内促进BRCA1驱动的肿瘤发生
● 基因特征分析和上皮分化的数学模型显示，基质诱导的增殖导致LP细胞的聚集和分化改变，从而增加BRCA1/mut中乳腺癌的风险
● 方法
● 分析了一组来自BRCA1种系突变携带者（BRCA1/mut；n=20）和非突变携带者（对照组；n=33）的非肿瘤性乳腺切除组织，并结合了scRNAseq、原位分析和功能性体外和体内实验。
● 意义
● 作者的研究结果表明，细胞间通讯的改变如何导致上皮内稳态失衡，最终导致癌症的发生。
● 该结果将为新的疾病监测和治疗策略奠定基础，以改善遗传性乳腺癌患者的管理。例如，前CAF特异性蛋白可作为癌前疾病起始的生物标记物，以告知是否需要进行双侧乳腺癌根治术。此外，MMP抑制剂可再次用于高危BRCA1突变妇女的初级癌症预防治疗。
Method
● 配体-受体相互作用分析
● 为了在虚拟制造技术（VMT）中量化潜在的细胞间旁分泌通讯，作者利用了Skelly等人编制的受体-配体相互作用列表（45），该列表产生于Ramilowski等人（46）。如果在特定细胞类型中20%的细胞某配体/受体的平均表达水平为0.1，则该配体或受体被定义为“表达”。因此，当受体和配体都在20%的细胞中以等于或大于0.1的水平表达时，该受体/配体相互作用被认为是存在的。为了定义这些相互作用网络，作者连接了任意两种细胞类型，其中一种表达配体，另一种表达受体。“增强的”受体-配体相互作用被定义为BRCA+/mut或对照细胞内独特的相互作用。为了绘制网络，作者使用了R包“circilize”中chorddiagram函数。GO Term分析的受体-配体相互作用，由基因列表富集分析工具“Enrichr”分析独特的BRCA或对照受体-配体对来确定。
● 文献45：Skelly, D. A. et al. Single-Cell Transcriptional Profiling Reveals CellularDiversity and Intercommunication in the Mouse Heart. Cell Rep. 22, 600–610(2018).
● 文献46：Ramilowski, J. A. et al. A draft network of ligand–receptor-mediatedmulticellular signalling in human. Nat. Commun. 6, 7866 (2015).
● scEnergy计算
● 文献32：Jin,S., MacLean, A. L., Peng, T. & Nie, Q. scEpath: energy landscape-basedinference of transition probabilities and cellular trajectories fromsingle-cell transcriptomic data. Bioinformatics 34, 2077–2086 (2018).
Result
● 1分类
● 背景：人类乳腺中的基质细胞与上皮导管和小叶紧密相连，它们通过分泌生长因子和细胞外基质（ECM）分子来调节上皮内环境稳定
● 假设：生殖系BRCA1/mut携带者在乳腺基质生态位中表现出改变，从而促进癌前上皮改变和癌症的发生
● 分类：上皮：基底细胞、管腔1细胞和管腔2上皮细胞。上皮相关基质：成纤维细胞、内皮细胞、周细胞。
● 成纤维细胞和周细胞共同点包括与间充质生物学相关的基因，包括EDNRB、PDGFRB、ZEB2和COL4A118
● 主要差异在于成纤维细胞中的ECM分子（COL1A2）和蛋白水解重塑物（MMP2、MMP3、MMP10），周细胞中的肌动蛋白结合（TAGLN、ACTA2）和内皮因子（PRORC、ESAM、MCAM、KCNE4）突出了它们的血管收缩功能
● 作者发现细胞表面标记物PRORC和PDPN分别标记周细胞和成纤维细胞（扩展数据图2f），这能够开发一种FACS策略，专门富集周细胞（PRORC+PDPN-）和成纤维细胞（PDPN+ PROCR MID）
● 2基质与上皮的相互作用
● 由于基质细胞通过旁分泌和近分泌相互作用在调节上皮内环境稳定中发挥关键作用，作者接下来探讨了与对照样品相比，BRCA1/mut中的表达模式增强的配体-受体相互作用
● 结果1：对照组中成纤维细胞和周细胞被发现与上皮细胞产生几种胶原/整合素相互作用，这在BRCA+/mut中表达不足
● 结果2：在BRCA1/mut中发现了几种富含的促肿瘤生长因子，包括来自成纤维细胞的FGF2和HGF，以及来自周细胞的NGF和INHBA
● 结果3：GO-term分析显示，BRCA1/mut样本显示周细胞和成纤维细胞的促增殖通路总体增加，而内皮细胞显示MAPK信号传导增加，这表明基质生态位的改变驱动了癌前乳腺组织中的上皮细胞增殖
● 结果4：细胞周期评分分析发现处于S期的BRCA1+/mut上皮细胞的百分比增加
● 为了在原位验证这一点，该研究在其他对照组（n=3）和BRCA1/mut（n=3）样本中对PCNA进行了免疫荧光染色，证实PCNA阳性上皮细胞数量增加了约2倍
● 3 周细胞分泌的NGF促基底细胞增殖
● 背景：
●配体受体分析显示NGF是BRCA+/mut周细胞中的促增殖因子，与基底细胞上的NGFR相互作用（图1d）。作者对血管（内皮细胞和周细胞）细胞状态进行了更详细的聚类分析，这证实了NGF在BRCA+/mut周细胞中显著过度表达
● 已知NGF可诱导癌细胞增殖，但尚不清楚其在癌前乳腺中是否作为微环境生长因子发挥作用。
● 验证：
● 这种相互作用得到了流式细胞荧光分选技术（FACS）结果的支持，即只有基底细胞表达NGFR
● 从功能上验证这一点，作者研究了在乳腺球形成试验中，当FACS分离的NGFR+基底细胞与外源性NGF一起培养时，其增殖是否增加。在生理相关的ECM水凝胶分析中，NGF的加入显著增加了基底细胞（而非腔细胞）的乳腺球的数量和大小，并增强了乳腺分支形态发生分支形态发生
●
● 4 成纤维细胞的pre-CAF表型并分泌MMP3
● 背景：成纤维细胞是通过分泌生长因子和ECM分子，调节正常的乳腺上皮内环境稳定的关键细胞，并作为CAFs促进肿瘤进展。
● 结果1：成纤维细胞密度分析显示，对照组和BRCA1+/mut之间的转录空间发生了明显变化
● 结果2：差异基因表达分析，发现BRCA1+/mut和对照成纤维细胞之间的基因表达存在显著差异。进一步的基因评分分析显示BRCA1+/mut成纤维细胞中CAF和iCAF标记基因的表达增加，表明BRCA1+/mut成纤维细胞在癌前阶段始终呈现“pre-CAF”表型。
● 结果3：Kaplan-Meier生存分析对1809名患者用前100个标记基因进行了队列研究，结果显示pre-CAF与预后不良的对照基因特征密切相关，强调了CAF前期人群的潜在疾病相关性。
● 结果4：与对照组相比，在所有个体中，分泌型蛋白酶-基质金属蛋白酶3（MMP3）是BRCA1+/mut成纤维细胞中发现升高的pre-CAF靠前的标记物之一。前人证明，MMP3可以通过Wnt信号、活性氧产生和增加基因组不稳定性来促进乳腺癌的发生，但MMP3在人类BRCA1/mut病理学中的作用尚不清楚。
● 验证MMP3
● 为了验证在原位蛋白水平上BRCA1/mut成纤维细胞中MMP3的表达是否增加，作者对额外的对照组（n=8）和BRCA1/mut（n=5）乳腺组织样本进行了免疫荧光分析。MMP3阳性基质细胞在BRCA1+/mut组织中的上皮结构附近扩张，提示在人类BRCA1+/mut中，促肿瘤MMP3与乳腺癌风险增加有直接联系。
● 为了从功能上确定成纤维细胞源性MMP3对人类乳腺上皮生物学的影响，作者使用原代人类乳腺成纤维细胞和乳腺上皮细胞（MECs）建立了3D基质上皮共培养分析。接下来，该研究在对照成纤维细胞中使用慢病毒MMP3过度表达（+MMP3），与仅对照GFP的成纤维细胞（GFP）相比，其显示出显著增加的生长。相反，在BRCA1/mut成纤维细胞中使用CRISPR/Cas9介导的敲除MMP3（-MMP3）可显著降低乳腺球的生长
● 为了确定MMP3是否直接促进上皮生长，作者接下来将重组MMP3添加到乳腺球生长试验中。发现外源性MMP3足以以浓度依赖的方式诱导乳腺球生长增加
● 这些结果表明，成纤维细胞源性MMP3在人体系统中以反式作用促进乳腺上皮生长。
● 小鼠实验——证明MMP3促BRCA1介导的肿瘤起始
● 目的：为了评估成纤维细胞源性MMP3对体内肿瘤启动的影响，该研究建立了BRCA1驱动的成纤维细胞-上皮细胞共移植小鼠模型
● 材料：简而言之，作者首先从Brca1 f11/f11 p53f5&6/f5&6 Cre c 小鼠中分离出癌前乳腺细胞。该研究还通过FACS分离（PDPN）人乳腺成纤维细胞，并慢病毒调节这些成纤维细胞，使其仅表达GFP（+GFP）或同时表达MMP3和GFP（+MMP3）
● 方法：在三个实验组（每组n=12）中对免疫功能低下的小鼠进行原位共移植:1.仅限乳腺细胞（对照组），2.乳腺细胞与对照GFP+成纤维细胞，3.乳腺细胞与含有MMP3+成纤维细胞
● 结果：①六周后，MMP3组（12/12）的肿瘤起始频率明显高于仅乳腺细胞组（4/12）和GFP对照组（8/12），表明成纤维细胞源性MMP3促进BRCA1介导的肿瘤起始。②此外，与两个对照组相比，根据肿瘤体积和质量显示MMP3组的肿瘤生长显著增加
● 这些结果表明，成纤维细胞源性MMP3在体内以旁分泌方式驱动BRCA1介导的乳腺肿瘤发生
● 5 基质细胞分泌的MMP3可以诱导上皮细胞中基底样分化改变的luminal细胞的扩张
● 目的：为了确定基质诱导的增殖是否会改变癌前BRCA1+/mut组织中的上皮分化，接下来进行了上皮细胞亚群聚类，并在细胞状态水平上对所有上皮细胞进行分类。为了确定具有祖细胞能力的细胞状态，作者使用了基于统计物理的方法，将增加的细胞状态转换概率量化为单细胞能量（scEnergy）。
● 发现1：发现BRCA1+/mut基底、luminal1和luminal2上皮细胞的scEnergy显著高于对照组
● 发现2：BRCA1/mut基底上皮细胞表现出标志性的管腔细胞角蛋白（例如KRT18、KRT8、KRT19）的转录增强，表明存在分化改变的现象。
● 为了验证这一点，作者对分离的基底上皮细胞中管腔（KRT19）和基底（KRT14）标记物的双重表达进行了单细胞western blot（scWB）分析，结果显示BRCA1+/mut中KRT19/KRT14双阳性基底细胞的百分比增加
● 先前的研究表明， luminal progenitors（即 luminal 1）是BRCA1+/mut相关乳腺癌的起源癌细胞。与之前的研究相比，并没有在BRCA1/mut中检测到luminal 1细胞的扩张。然而，作者在luminal 1细胞内的详细分析显示，BRCA1/mut luminal 1细胞中basal标志基因（如KRT5、KRT14）以及luminal progenitor基因（如ALDH1A3）上调. 此外，luminal 1细胞的基底细胞基因评分增加，但其他上皮细胞类型相关基因标记没有增加。这一观察得到了原位免疫荧光的证实，BRCA1/mut组织中KRT14/KRT19双阳性管腔细胞的百分比显著增加。
● 同样的luminal1-ALDH1A3+亚群也被发现表达高水平的KRT23。为了验证这一发现，作者对从对照组（n=3）和BRCA1/mut组织（n=3）分离的上皮细胞进行了单细胞Western blot（scWBs）分析，显示BRCA1/mut患者的KRT23管腔上皮阳性率较高。原位免疫荧光分析显示BRCA1/mut中KRT23阳性管腔细胞数量增加，进一步证实了这一点。
● 为了确定基质MMP3表达是否直接诱导分化改变，作者对来源于MMP3过度表达或对照（GFP）成纤维细胞共移植的肿瘤进行了原位分析，结果显示基质MMP3过度表达时的KRT5/KRT8双阳性肿瘤细胞表达显著增加
● 结论：数据显示有基底样分化改变的luminal细胞扩张，这与之前的观察结果一致。重要的是，这篇研究表明，改变的分化表型可以通过基质细胞诱导，例如通过分泌的MMP3。
● 6 模型预测
● 目的：试图评估基质细胞诱导的上皮细胞增殖是否可能是BRCA1+/mut中祖细胞扩张和乳腺癌风险增加的原因。
● 背景：BRCA1单倍体不足与增殖过程中基因组不稳定性增加有关，因此增殖增加可能进一步加速获得BRCA1杂合性缺失或第二次致癌命中的过程
● 为此，这里使用了一种数学建模方法，基于先前开发的乳腺干细胞和祖细胞层次模型，模拟癌症祖细胞的种群动态。作者模拟了BRCA1和其他癌基因（如p53）在癌症发生过程中的顺序突变（扩展数据图10a）。结果显示，2倍的基质诱导的增殖增加会导致潜在癌祖细胞群的显著积累（扩展数据图10b-e），这与在BRCA1+/mut中发现的 uncommitted luminal progenitor cell扩增一致
● 为了更真实地预测人类寿命中的癌症风险，作者使用了随机突变模型，该模型假设获得性突变会导致癌细胞适应性的随机变化。我们的模型预测，增殖增加2倍会导致癌症总风险显著增加（扩展数据图10f）。这表明，基质细胞诱导的增殖可能与BRCA1+/mut中的祖细胞扩张和乳腺癌风险增加直接相关
● 结论：确定了基质细胞群的恶性前改变，这在人类BRCA1+/mut中提供了一个有利的促肿瘤生态位，诱导KRT23阳性的管腔祖细胞亚群扩增
● 研究意义：许多其他研究已经描述了BRCA1/mut癌前组织的特征，包括使用ScRNA序列。虽然这些研究主要集中在上皮细胞上，但目前的研究揭示了不同基质细胞群（如pre-CAF）中明显的肿瘤前变化。此外，该研究表明，基质细胞以反式方式驱动遗传性乳腺癌，这可能为新的疾病监测和治疗策略铺平道路，以改善BRCA1+/mut患者的管理。例如，该结果表明，MMPs，尤其是MMP3，可能是BRCA1+/mut携带者初级癌症预防的一个有希望的药物靶点。尽管MMP抑制剂在之前的临床试验中被作为抗癌药物进行了测试，结果大多令人失望，但针对晚期癌症患者的不良研究设计可能是这些试验结果的原因。该研究表明，在高危BRCA1突变女性的初级癌症预防治疗中，应研究靶向基质-上皮相互作用，例如与MMP抑制剂的相互作用。
思考
● ①样本量大：BRCA1种系突变携带者（BRCA1/mut；n=20）和非突变携带者（对照组；n=33）的非肿瘤性乳腺切除组织
● ②聚焦基质细胞提供大量促增殖旁分泌信号，诱导上皮细胞增殖。
● ③工作做得很细致深入：
● 细胞方面：
● FACS分离的NGFR+基底细胞与外源性NGF一起培养,乳腺球形成试验
● 用原代人类乳腺成纤维细胞和乳腺上皮细胞（MECs）3D基质上皮共培养分析（慢病毒MMP3过度表达/CRISPR/Cas9介导的敲除MMP3）
● 小鼠方面：
● Brca1 f11/f11 p53 f5&6/f5&6 Cre c 小鼠中分离出癌前乳腺细胞。作者还通过FACS分离（PDPN）人乳腺成纤维细胞，并慢病毒调节这些成纤维细胞，使其仅表达GFP（+GFP）或同时表达MMP3和GFP（+MMP3）
● 在三个实验组（每组n=12）中对免疫功能低下的小鼠进行原位共移植:1.仅限乳腺细胞（对照组），2.乳腺细胞与对照GFP+成纤维细胞，3.乳腺细胞与含有MMP3+成纤维细胞
● 免疫荧光、单细胞western blot等
● 计算scEnergy，两种数学模型预测
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