免疫治疗丨免疫检查点抑制剂生物标志物之Neoantigen

随着肿瘤免疫治疗时代的到来，免疫检查点抑制剂的研发和审批的进步，确保了免疫检查点抑制剂已经作为肿瘤治疗的新的有效方法之一。临床研究显示，单独使用PD-1抑制剂，只有20-40%的病人会对免疫治疗产生反应，医生很难知道免疫疗法是否对某个病人有效，如何筛选出这部分有应答的患者则是临床所面临及需要解决的问题 。（经典型霍奇金淋巴瘤是一个例外，单独使用，有效率高达80%以上）

有没有生物标志物（Biomarker）能够预测对免疫检查点抑制剂的反应？开发生物标志物对于帮助患者分层以及预估患者是否对免疫阻断单独疗法有反应，是否需要组合疗法或者接受其他的治疗是必要的。

精准医学始于靶向治疗，免疫治疗从一开始就在思考能否利用靶向治疗开辟新的成功路径。就目前而言，免疫治疗已经开辟了通向精准治疗的各种路径。

目前，影响 Immune checkpoint inhibitor（免疫检查点抑制剂）的有效生物标志物包括：PD-L1，MSI，dMMR，TMB，Neoantigen等，更多反映免疫疗效的生物标志物还在不断的研究与试验中。

今天我们聊聊肿瘤的新生抗原（Neoantigen），Neoantigen也是目前比较火热的免疫检查点抑制剂生物标志物之一。说的直白点，免疫治疗反应的生物标志物不是MSI，不是dMMR，甚至也不是TMB，而是肿瘤细胞产生的Neoantigen，肿瘤细胞产生的新生抗原则是可以直接评估免疫治疗响应的。

The ultimate biomarker for immunotherapeutic response is not MSI（dMMR） or even the mutational burden （TMB） but the presence of immunogenic neoepitopes. This could potentially be assessed more directly with future assays, leading to more precise guidance of immunotherapy.

新生抗原（Neoantigen）是只在肿瘤细胞中特异性表达的蛋白，能被免疫系统T细胞识别和杀伤，是肿瘤免疫治疗的理想靶标，是可以预测PD-1抑制剂等免疫治疗的疗效的。

肿瘤细胞在其发生发展过程中，会产生很多基因突变，包含同义突变和非同义突变，其中非同义突变会改变氨基酸编码序列，导致肿瘤细胞表达正常细胞所没有的异常蛋白。这些蛋白质，很有可能也会激活免疫系统，并引来免疫系统对肿瘤细胞的攻击。这些由肿瘤细胞基因突变所产生的能够激活免疫系统（能被活化的T细胞所识别）的异常蛋白质（异常抗原），就是新生抗原，Neoantigen。

新生抗原（Neoantign）有两个重大的特点：一是肿瘤细胞所特有，正常组织或细胞是没有的，所以称为“新生”；二是这些异常的蛋白质，能被免疫系统识别，能激活免疫细胞（并不是所有的异常蛋白质都能激活免疫系统），只有那些能激活免疫细胞的，才能被称之为“抗原”。

在之前TMB介绍的那篇文章中，我们有提到：肿瘤免疫原性是启动肿瘤免疫治疗的基础，所以能够产生与MHC高亲和力结合的新生抗原，免疫应答的可能性就会越高。

通过上图可以发现，TMB>10的黑色素瘤，经常会产生新抗原（frequently），对PD-1抑制剂敏感，这是黑色素瘤对PD-1抑制剂效果更好的原因之一；很大一部分肿瘤1<TMB< 10，能够产生新抗原（regularly），对PD-1抑制剂可能敏感；对于TMB<1的，几乎不太可能产生新抗原（occasionally），对PD-1抑制剂则不敏感。

肿瘤新抗原产生过程

• 肿瘤突变包括“同义突变”和“非同义突变” ;

• 非同义突变会改变氨基酸编码序列，导致肿瘤细胞表达正常细胞所没有的异常蛋白；

• 这些异常蛋白，如果在肿瘤细胞内被降解成内源性抗原肽，与MHC-I类分子高亲和力结合，并以复合物形式呈递到细胞表面；

• 被T细胞识别为“非己” （nonself），引起T细胞活化，进而肿瘤细胞被效应T细胞攻击和清除；

• 这种会引起T细胞活化的异常蛋白即我们所称的“新抗原”(neoantigen)，能够产生新抗原的突变即为具有免疫原性的突变（immunogenic mutation）。

1.体细胞突变→2.转录成突变mRNA→3. 蛋白酶加工突变蛋白→4. TAP介导的肽段转运进入内质网腔→5.与MHC I类复合物结合→6. T细胞识别细胞表面新抗原。

TMB那篇文章有提到：一般来说，TMB等于6.5的突变（FMI算法），相当于肿瘤基因组编码区含有100个非同义突变（100个同义突变），这些非同义突变中只有1%（范围0.07%~10%）可以产生与MHC高亲和力结合的突变肽段，能够与MHC高亲和力结合的肽段又只有50%能够被肿瘤患者体内的T细胞识别, 这些被能被T细胞识别的肽段中约有30%~40%可以被正常呈递到肿瘤细胞表面，能呈递到表面的肽段只有约30%能激发免疫反应。也就是100个非同义突变大约能产生1个有效的新抗原。TMB=6.5，最终可能也只产生1个新抗原。因此理论上TMB越高，最后能够被T细胞识别的新抗原产生也越多。但是，TMB仅代表产生肿瘤新抗原的可能性，不代表新抗原质量！！！

肿瘤新抗原增强肿瘤免疫

肿瘤新抗原可以增强肿瘤治疗的免疫响应率：肿瘤细胞内蛋白质降解产生的多肽能被HLA呈递到细胞表面，细胞毒性CD8+ T细胞的TCR识别多肽-HLA复合物，含有肿瘤突变的特异性肽段-HLA复合物与TCR有更高的亲和力，激活T细胞免疫反应，从而杀伤清除肿瘤细胞。

肿瘤突变、新抗原及免疫原性的关系：新抗原是指有含有突变AA且有免疫原性的肽段，是突变蛋白的降解产物。很多含有突变AA的肽段，由于没有免疫原性，也不能新抗原。插入/删除及移码突变导致氨基酸序列和空间结构改变会比较大，与MHC分子结合的亲和力会更强，被T细胞识别为新抗原的可能性越大。基于突变类型的分析，会不会更好？（有文献报道，相比于点突变产生的肽段，与HLA高亲和力的肽段是3倍富集在indel产生的突变肽上;  与HLA特异性高亲和力的肽段则是9倍富集在indel产生的突变肽上）

突变类型与免疫原性

新抗原引起的免疫反应

肿瘤免疫循环从肿瘤细胞释放特异抗原开始，到杀死肿瘤细胞结束主要分为7个步骤：

1）肿瘤细胞死亡并释放肿瘤特异抗原；

2）抗原呈递细胞（APC，树突细胞DC是专职原呈递细胞）表面的MHC复合物与肿瘤特异抗原形成抗原肽-MHC复合物；

3）抗原呈递细胞进入淋巴结激活T细胞（具体参见ICPI的原理）； 

4）激活的细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）离开淋巴结进入循环系统，并至肿瘤组织部位；

5）细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）穿过血管壁浸润到肿瘤微环境；

6）细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）通过特异性受体识别肿瘤细胞； 

7）肿瘤细胞被细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）识别并溶解消灭。

肿瘤新抗原预测流程

目前新生抗原的预测存在很多难题，预测哪些肿瘤突变会产生能被免疫系统识别的新生抗原，每个公司都有一套自己的算法和流程，很难统一；其中涉及到HLA，表达定量，MHC亲和力预测等等问题。

下面简单介绍下肿瘤新生抗原的检测是如何进行预测的：

• 我们需要找到肿瘤的突变，那么对样本的要求就是尽可能的是肿瘤组织（ctDNA可能会遗漏部分突变），并且用最大的panel（WES）尽可能找出所有的突变信息；

• 按照血液白细胞的WES数据确定HLA分型；

• 在WES检测到的体细胞变异 （包括非同义SNV和Indel）位点上下游区域找出产生长度为8，9，10，11的突变肽段；

• 在转录组水平上筛选出在RNA水平上有检测到表达的突变肽段；

• 利用NetMHC等软件预测每条突变肽段以及相应野生型肽段与HLA的亲和力；

• 基于预测的亲和力过滤（突变肽段-HLA亲和力）；

• 验证并确定Neoantigen通过体内外免疫学分析，挑选、验证并确认Neoantigen。

A framework for identifying and targeting tumour neoantigens：一种识别和定位肿瘤新生抗原的框架：

最后，我们来看看国内一些公司报告中的关于新生抗原的分析与解读

来源于国内某家公司WES报告的DEMO文件

来源于国内某家公司WES检测预测新抗原

新生抗原虽好，但是目前也是处于科研阶段，应用到临床还需假以时日！

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