NTRK融合在儿童恶性肿瘤中的发生比例更高，AMP技术助力NTRK融合有效检测
导读：
我国儿童恶性肿瘤的发病率近十年每年都以2.8%左右的速度在增加，其中城市儿童恶性肿瘤的发病率上升了18.8%。我国每年新增的3万～4万名儿童恶性肿瘤患者中主要为血液系统肿瘤（如白血病和淋巴瘤）、中枢神经系统肿瘤（如脑胶质瘤）和颅外恶性实体肿瘤(如软组织肉瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤和肾癌等)，血液肿瘤和中枢神经系统肿瘤约占儿童恶性肿瘤的50%左右。
从临床治疗效果上看，儿童恶性肿瘤患者的临床治愈率显著高于成人恶性肿瘤患者，规范化的诊疗可使得70%以上的儿童肿瘤患者得到临床治愈。随着基因测序技术在临床上的广泛应用，儿童恶性肿瘤的分子特征也得到了深入的研究。在儿童血液肿瘤中，超过30%的患者携带有融合重排和易位事件（如:BCR-ABL、PML-RARα、AML1-ETO和CBFβ-MYH11等）；近年来也在儿童实体肿瘤中发现了越来越多的融合重排变异事件。
近日，美国费城儿童医院（CHOP）的专家在JCO Precision Oncology杂志上发表了一项针对儿童恶性肿瘤患者基因变异情况的大队列研究，分析了神经营养因子酪氨酸受体激酶（NTRK）融合的发生比例、融合伙伴的分布及临床靶向治疗的效果。发现与成人肿瘤相比，NTRK融合在儿童肿瘤中更为常见，而且涉及的肿瘤范围也更广，并进一步证实了NTRK融合是FDA批准的NTRK抑制剂治疗的疗效生物标记物。强调了针对所有儿童肿瘤筛查NTRK基因融合具有重要的临床意义，NTRK基因融合阳性的儿童肿瘤患者可从NTRK-TKI（Larotrectinib或Entrectinib）的治疗中临床获益。
背景：
近年来随着NGS在临床肿瘤诊疗上的广泛应用，儿童恶性肿瘤的分子特征也得到了深入的研究，国际上已有多项儿童恶性肿瘤精确医学计划的研究结果公布[1]（图1），发现儿童肿瘤的分子变异特征及驱动基因变异与成人肿瘤存在显著的差异。
图1.目前已完成的多项儿科肿瘤精确医学计划。
2018年3月发表在Nature上的迄今为止包含血液肿瘤和实体瘤在内的多种儿童癌症的最大队列的基因组全面分析的两篇研究结果显示[2,3]：1. 只有30%～45%的儿童癌症驱动基因与成人癌症的相一致，表明儿童癌症的治疗策略与成人癌症存在很大不同，需要更加具有针对性的治疗方法；2. 促进儿童癌症产生的基因变异中，62％为基因结构变异（融合、重排及易位）和基因拷贝数的改变，显著高于大家普遍认为的DNA点突变及插入缺失，即大多数儿童癌症通常是由基因融合重排、染色体易位和特定基因拷贝数增加或缺失所引发的；3. 儿童癌症更多是由单个基因变异驱动，且导致儿童癌症的变异，往往只特定地发生于某一类型的癌症中，而不像成人的癌症那样，不同癌症可以具有同样的基因变异；4. 许多新的靶向药物缺乏儿童使用剂量指南和对儿童的疗效数据。这两项研究同时也指出：对儿童恶性肿瘤患者进行广泛的基因检测，有助于对疾病进行精细化分类及指导精准的个性化治疗，从而实现更加精准的疾病管理，以期一步提升临床治愈率。
神经营养酪氨酸受体激酶A/B/C基因(NTRK1/2/3)的融合重排编码的包含完整NTRK激酶结构域的融合蛋白是成人及儿童的多种恶性肿瘤的致癌驱动因素，FDA已经批准了Larotrectinib和Entrectinib两款NTRK-TKI用于治疗携带NTRK基因融合变异，且没有已知获得性耐药突变的成人和儿童泛实体瘤患者。这两款药物治疗NTRK 基因融合阳性的患者显示出较高的缓解率和持久的应答，并可显著改善患者生活质量。
NTRK基因融合变异在成人肿瘤中已被广泛研究报道，但在儿童肿瘤中目前的研究认识相对较少。在儿童恶性肿瘤中，NTRK融合在某些癌种中的发生率很高（>90%），如婴儿纤维肉瘤、先天性中胚层肾瘤和分泌性癌，而在儿童甲状腺乳头状癌和部分儿童脑胶质瘤中，NTRK融合发生率相对较低（5%～26%）。NTRK融合的发生具有一定的组织学特异性。
研究内容：
近日，在JCO Precision Oncology杂志上发表的一项迄今为止最大的未加筛选的儿童肿瘤NTRK基因融合研究中[4,5]，费城儿童医院（CHOP）的研究人员分析了NTRK融合在儿童肿瘤中的发生频率、融合伙伴和临床结果。该研究运用DNA和RNA的NGS对2016年3月至2019年9月间的1217例儿童恶性肿瘤患者的1347个肿瘤标本进行了肿瘤基因组测序分析，在27例患者的29个肿瘤中发现了NTRK融合，所有儿童肿瘤中NTRK基因融合的阳性率为2.22%，其中实体肿瘤中NTRK基因融合的阳性率为3.08%。
检测方法：
RNA检测：CHOP Cancer Fusion Panel（CCFP，110基因），采用AMP（单端锚定多重PCR，ArcherDx）技术进行基因融合的检测（可检测已知及未知融合），Illumina HiseqPE150测序平台，检测到的所有融合结果均采用RT-PCR和Sanger测序进行验证。
DNA检测：CHOP Hematological Malignancy Panel（CHMP，血液肿瘤产品，118基因）或CHOP SolidTumor Panel（CSTP，实体肿瘤产品，238基因）对SNV(单核苷酸变异)，Indels（短片段的插入/缺失）和CNV（拷贝数变异）进行检测。
儿童肿瘤NTRK融合变异情况：
在27例儿童肿瘤患者的29个肿瘤中检测并验证到NTRK融合，所有肿瘤的NTRK融合阳性率为2.22%（27/1217），实体肿瘤的NTRK融合阳性率为3.08%（25/812）。NTRK融合在甲状腺乳头状癌（PTCs）中检出率为13.70%（10/73），发生比率最高；在中枢神经系统（CNS）肿瘤中检出率为2.07%（7/338）；在非中枢神经系统肿瘤和非甲状腺乳头状癌的实体瘤中检出率为2.00%（8/401）；在血液系统恶性肿瘤中检出率仅为0.49%（2/405）。（图2）
图2.儿童恶性肿瘤中各癌种中的NTRK融合发生比例。
其中NTRK2融合仅在中枢神经系统肿瘤中发现；NTRK1融合主要集中在甲状腺乳头状癌中；NTRK3融合在所有肿瘤类型中均有发现。
NTRK融合在儿童肿瘤中比成人肿瘤中更常见（2.22% vs 0.28%）；在儿童肿瘤中NTRK融合发生比率最高的甲状腺乳头状癌中，其发生率也显著高于成人的发生率(13.7% vs 2.22%)[6]（图3）。涉及到的融合伙伴和儿童肿瘤范围比以前认识的更为广泛。
图3.儿童肿瘤中NTRK融合的发生率是成人肿瘤中的发生率的近10倍。
在其他的研究中也证实了少年儿童甲状腺癌患者中NTRK的融合发生比例较高。2020年12月发表在Thyroid上的一项研究表明[7]：融合基因是青少年甲状腺乳头状癌（PTC）中最常见的基因改变，57%的青少年PTC 患者携带融合基因变异(20/35) ；其中7例为NTRK1/3融合，即青少年PTC 患者中NTRK的融合发生率高达20%。（图4）
图4.青少年甲状腺乳头状癌患者中NTRK融合的发生率高达20%。
NTRK融合检测可辅助精准诊断，指导治疗和评估预后：
研究对检测为 NTRK融合阳性的患者进行了6至46个月的随访，所有患者均可获得随访信息。
辅助诊断：在所有的病例中，NTRK融合的检测均证实了病理形态学的诊断，其中5例肿瘤的最终诊断主要基于NTRK融合的检出。1例分泌性癌，最初诊断为粘液表皮样癌，但后续检测到ETV6-NTRK3融合并结合额外的免疫组化评估后最终确诊为分泌性癌。
指导治疗：1例诊断为婴儿纤维肉瘤的6个月大的男婴经FISH检测为ETV6重排阴性的中至高级别间质肿瘤，由于手术切除可能会导致上肢肌肉损伤的严重并发症，风险极高，经NGS检测后发现了一个新的NTRK融合：SPECC1L-NTRK3，随后接受了Larotrectinib的治疗，肿瘤明显缩小，经过6个疗程的治疗后，具备了手术切除的条件进行了手术切除。患者术后继续使用Larotrectinib治疗6个周期，MRI显示术后6个月无病灶残留和复发。
评估预后：研究人员对所有NTRK融合阳性患者的临床结果进行了长达46个月（中位随访时间为21个月）的评估。所有非中枢神经系统肿瘤、非甲状腺乳头状癌等实体瘤在手术切除后（无论是否接受术后放疗或化疗）均表现出优异的疗效，中位随访时间为32.5个月；甲状腺乳头状癌患者的中位随访时间为21.5个月；中枢神经系统肿瘤患者的中位随访时间为21个月。文章数据采集截止时，在6例ETV6-NTRK3融合阳性的甲状腺乳头状癌中，均没有发生疾病进展，有3例在接受或不接受RAI（放射碘-131）治疗的情况下均获得了缓解。而在4例NTRK1融合阳性的甲状腺乳头状癌中，3例通过RAI（放射碘-131）治疗没有达到疾病缓解。NTRK融合阳性的大多数低级别神经胶质瘤（LGG）在无需额外治疗的情况下全切后表现出良好的结果。
小结：
包括了1217例儿童恶性肿瘤患者队列的基因变异分析的研究结果，进一步证明了单核苷酸变异（SNV）变异主要集中在中枢神经系统肿瘤和血液系统恶性肿瘤中，而拷贝数变异（CNV）则主要集中在非中枢神经系统实体瘤中。发现NTRK融合在儿童恶性肿瘤中的发生率为2.22%，在儿童实体瘤中的发生率为3.08%。该研究表明，NTRK融合在儿童肿瘤中比成人肿瘤中更为常见，涉及的融合伴侣和儿童肿瘤范围比以前认识的更为广泛，这一信息有助于优先筛选出能够从NTRK抑制剂治疗中获益的儿童癌症患者。NTRK融合的识别有助于癌症的精准诊断和NTRK抑制剂的精准靶向治疗，强调了针对所有儿童肿瘤筛查NTRK基因融合的临床重要性和实用性。
非常值得注意的是在本研究中，患者的样本同时进行了DNA和RNA的测序，能够更加全面地检测到驱动变异，最大限度的避免了漏检和错检。2020年10月发表在Nature Medicine上的澳大利亚“零儿童癌症计划”研究表明[8]：仅使用DNA-base的测序检测可检测到35.1%的儿童恶性肿瘤患者中携带有基因变异，当增加了RNA-base的测序检测后，这一比例提升至39.9%，提高了近5个百分点。DNA-base检测可准确地检测点突变、插入缺失和基因突变特征谱，RNA-base测序则可更加有效地检测出驱动融合基因变异和异常表达的基因，两者的有机互补在临床诊疗上非常重要。
在本研究中RNA测序使用的CHOP Cancer Fusion Panel是基于AMP（单端锚定多重PCR，ArcherDx）技术开发的。AMP技术是由恒特基因的首席科学家郑宗立博士在哈佛医学院麻省总医院工作期间，为解决融合基因检测困难，克服传统方法FISH、IHC、RT-PCR以及DNA-base NGS的固有缺陷而发明的[9]。AMP这一单向滑动RNA测序的方法，不仅能够检测已知的融合类型，还可以检测出未知融合类型，而无需预知融合伙伴和融合断点位置的信息，目前已被包括：纪念斯隆凯特琳癌症中心、MD安德森癌症中心和哈佛医学院麻省总医院等世界顶尖医院采用，用于癌症基因变异特别是融合重排等结构变异的检测，并被业界公认为检测融合重排的最佳技术。
图5.郑博士等研究人员发表在《Nat Med》的AMP技术的方法学介绍。
AMP技术虽然性能卓越，但其开发的检测产品仍需要将DNA和RNA分别提取分开建库的检测模式，不仅增加了检测费用，同样也存在耗费样本量较大的问题。故迫切需要一种更加理想的临床实践解决方案。
恒特基因成立伊始，就一直致力于开发更优的基于RNA靶向测序检测融合变异的技术和产品。恒特以RNA为模板，开发了深度改良的单端锚定多重PCR建库方法---PANO-Seq ®技术进行融合检测，结合针对性的生信流程分析异常拼接的外显子，能实现融合基因检测的高准确度，有效避免漏检和错检。为了简化检测流程并且提高检测结果的全面性和准确性，恒特基因发明了一种在单个反应体系中同时将DNA和RNA模板构建成用于NGS检测的文库的“一管双检”方法(图6)，可同时检测所有变异类型，以DNA为模板检测单核苷酸变异（SNV）、插入缺失（Indels）、拷贝数变异（CNV）和融合（Fusion）等基础之上，充分的发挥了RNA模板检测基因结构变异（融合，重排，易位，RNA剪接异常）和表达的优势。相关方法学文章已于去年发表在临床检测和诊断领域顶级期刊《Clin Chem》上[10]。DNA+RNA“一管双检”的产品兼顾检测的全面性和准确性，将上述问题迎刃而解，基于“一管双检”的PANO-Seq ®技术开发的基因检测产品必将为更多的肿瘤患者带来临床获益。
图6. DNA+RNA“一管双检”PANO-Seq ®技术特点与目前国内外其他DNA+RNA模式特点的比较。
参考资料：
[1]. Molecular characteristics and therapeutic vulnerabilitiesacross paediatric solid tumours
[2]. The landscape of genomicalterations across childhood cancers. Nature . 2018 Mar 15;555(7696):321-327.
[3]. Pan-cancer genome andtranscriptome analyses of 1,699 paediatric leukaemias and solid tumours. Nature. 2018 Mar 15;555(7696):371-376.
[4]. NTRK Fusions Identified inPediatric Tumors: The Frequency, Fusion Partners, and ClinicalOutcome. JCO Precision Oncology, 2021; (5): 204 DOI: 10.1200/PO.20.00250.
[5]. 微信公众号：基因Talks . 儿童肿瘤丨研究人员发现NTRK基因融合在儿童肿瘤中比预期的更为常见！
[6]. TRK Fusions Are Enriched inCancers with Uncommon Histologies and the Absence of Canonical Driver Mutations.Clin Cancer Res . 2020 Apr 1;26(7):1624-1632.
[7]. RET, NTRK, ALK, BRAF, and METFusions in a Large Cohort of Pediatric Papillary Thyroid Carcinomas. Thyroid .2020 Dec;30(12):1771-1780.
[8]. Whole genome, transcriptome andmethylome profiling enhances actionable target discovery in high-risk pediatriccancer. Nat Med . 2020 Nov;26(11):1742-1753.
[9]. Anchored Multiplex PCR for Targeted Next-generationSequencing. Zheng et al.,Nature Medicine. 2014 , 20 (12) :1479-1484.
[10]. Simultaneous Detectionof Gene Fusion and Base Mutations in Cancer Tissue Biopsies by Sequencing DualNucleic Acid Templates in Unified Reaction. Clin Chem . 2020 Jan1;66(1):178-187.
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