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原代细胞培养注意事项

The following article is from 科研讲坛 Author 小六儿

今天,小六儿想跟大家分享一些培养原代细胞的经验,以我自己培养的小鼠肺微血管内皮细胞为例,希望能够帮助大家排除一些雷区。

小鼠肺微血管内皮细胞,来自网络

对原代细胞最直观的理解,就是不能无限传代下去,不论你是自己提取的细胞还是从试剂公司购买的细胞,都会建议你在P2-P3代完成实验是最好的。但是我们都知道,对于细胞实验的需求量,P2-P3代的细胞数量很难满足。所以,掌握提取和培养原代细胞的技巧,尽可能地让细胞的好状态多维持几代,对实验成败来说至关重要。


提取原代细胞

比如说小鼠动物实验,造模成功后,自己动手提取细胞。这样做的好处是实验组和对照组小鼠数量较多,在一定程度上可以保证细胞来源不会中断。不足的地方在于,提取成功率对个人操作技术和实验室环境的要求很高。而且,我们还需要对细胞进行鉴定,这也是一项技术上的考验。小六儿在提取小鼠微血管肺内皮细胞时,结合了《组织和细胞培养技术》第三版里的方法,加上自己的一些改良,总结如下:

图片来自网路

1.  原代内皮细胞提取

1)  整个操作要在洁净通风的超净台下进行,所有的器材要高压消毒。

2)  根据BALB/c小鼠的体重,用10ml/kg 3%浓度的戊巴比妥钠麻醉;将小鼠置于盛有75%乙醇的烧杯内,这一步不仅可以消毒,也可以让小鼠体毛浸湿,后续剃去皮毛的时候不会沾到剪刀或组织上。

3)  用镊子轻轻挑起小鼠的心脏,装有PBS的注射器插入心尖,同时在右心耳处剪开一个小口,缓慢推动注射器,随着心脏的跳动,将体内的血液冲洗出来。

4)  取出小鼠的肺部组织,将肺组织切成小米粒样的大小,置于预冷的HBSS中反复冲洗几次。

5)  将小米粒大小的肺组织置于培养瓶中(培养瓶前一天用1%明胶溶液包被培养面,4度过夜,小鼠处理前,将培养瓶放置培养箱中,使其温度恢复至37度),置于培养箱37度的环境下,消化4个小时。

6)  消化4小时后,加入RPMI 1640培养基(有10%血清、1%双抗、1%内皮细胞生长因子)10ml(第一次添加培养基,可以是正常培养时的2倍量),继续培养24小时(继续培养的时间可根据细胞贴壁情况适当调整)。

7)  24小时后,取出肺组织,镜下观察细胞状态,换液。

8)  原代细胞的提取和培养是很慢的过程,一般需等到24小时后,才能在镜下看到些许细胞群,一周到两周后才会看到鹅卵石样的排列情况。

9)  原代细胞2-3天换液一次,因为内皮细胞生长形成单层时,会出现接触抑制现象。所以,内皮细胞生长接近单层时就可以传代了,不要等到长得非常满。

2.  内皮细胞鉴定:可以做CD31和VEGF受体免疫荧光染色。

 

试剂公司购买原代细胞

小六儿还是建议大家,如果有条件的话,还是要从靠谱的公司购买需要的细胞。优点在于节省实验时间,而且公司会提供相应的细胞鉴定。而且从技术层面而言,公司提供的原代细胞确实会比自己提取的纯正很多。对于动物细胞而言,公司只会提供免疫荧光鉴定结果,不会有STR,这些材料都要保存好,很多投稿杂志都需要提供这方面数据。购买的细胞需要注意以下几点:

1.  收到细胞时,要镜下观察是否有污染情况;收到细胞的前几天,要做好各种倍数的镜下拍照记录,以防细胞出现问题后,可以跟公司很好地沟通。

公司购买的细胞,100倍镜下

2.  收到细胞后,不要马上处理。应置于培养箱中静置4h以上再操作。如果不着急,可静置过夜。

3.  细胞的第一次传代,一定要密度高一些传代,原代细胞传代密度低,很难长起来。建议1:2-1:3传代。

4.  原代细胞传代时(内皮细胞,贴壁为例),0.25%+0.53nM的胰酶消化,1ml消化液37度培养箱内消化30sec,再加入5ml培养基(正常消化贴壁细胞,我们使用胰酶和培养基的量是1:1,但是原代细胞必须用大量培养基中和胰酶)。

5.  原代细胞不建议冻存,因为冻存很容易复活不成功。如果要冻存的话,建议在P2或P3代冻存,冻存液中的血清越多越好,建议比例9(血清):1(DMSO)。

6.  原代细胞复苏时,置于37-38度水浴融化细胞,并加入10ml培养液(正常贴壁细胞复苏时,也可以使用这种比例,复苏成活率会大大提高),离心重悬铺板。


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