查看原文
其他

肿瘤TRANSWELL实验,真有那么难么?一文搞定它

The following article is from 科研讲坛 Author Nelly

一提到对肿瘤的研究,必离不开对细胞功能的研究,其中肿瘤细胞的迁移、侵袭功能研究是必不可少的,肿瘤细胞的迁移侵袭能力的研究,也为后续信号通路、功能机制研究打下基础。所以,做好TRANSWELL实验是多么的必要,下面我们将详细介绍TRANSWELL这个实验。

所谓TRANSWELL,顾名思义,TRANS-词根具有转运,转移,移动的意思,WELL-为小室的意思,两个词合起来就是穿过小室的实验,很多人到这里并没有想象到这是个什么装置,下面以corning公司(也可以是其他家的,大同小异)的24TRANSWELL小室为例给大家讲解。

图1. Transwell孔板


首先要说一下,示例的这个小室为24孔板,打开后发现真正可以做的为12个孔(图1),单个一个小室的话,如示例(图2);肿瘤迁移与侵袭实验常用8.012.0μM的膜就足够,在肿瘤迁移实验时,在上室中我们加上无血清的培养液与细胞,在下室加入有血清的培养液,相当于肿瘤细胞在上室没有食物,本能会向下室有食物的培养基跑去,而我们所要检测的就是细胞跑下去的能力,换句话说,细胞跑下去的越多,肿瘤迁移的能力也就越强,如示例图3

图2. Transwell单个小室


图3. 肿瘤Transwell迁移示意图


在肿瘤侵袭实验时,其原理与肿瘤迁移一致,只不过在聚碳酸酯膜上室侧铺上一层基质胶(matrigel),用以模仿体内细胞外基质,细胞欲进入下室,先要分泌基质金属蛋白酶(MMPs)将基质胶降解,方可通过聚碳酸酯膜。计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的侵袭能力,如示例图4

图4. 肿瘤Transwell侵袭示意图


下面将介绍TRANSWELL的详细实验步骤及每一步笔者的一些经验供大家分享:
1、复苏细胞,将细胞复苏于含有10%的血清中培养传代,传至2-3代时进行加药处理或者饥饿处理18-24小时,这一步我们要保证细胞的状态是否正常,无论加药与否,都需要大家前期在细胞方面注意

2、4度冰箱中溶解matrigel胶,这一步切记,不要把胶在室温存放太长时间,否则胶就凝固啦,室温下的胶在没有稀释的情况下很容易凝固,也就不能用了;

3、提前将实验所用到的细胞小室,枪头等放入4度中预冷,同理,防止胶过早凝固,我们需要将实验所需的东西全部预冷;

4、用无血清的培养基稀释matrigel胶,加入到上室,具体的浓度小伙伴们可以看一下所购买的matrigel胶的说明书,有推荐的比例与稀释浓度,且这一步必须在冰上进行,也是防止胶在没有稀释的时候凝固,而且matrigel胶真的很贵,所以刚拿到胶的小伙伴一定记住要及时分装哈。不同的细胞适用于不同的胶的浓度,浓度过高过低都会影响实验的结果,肿瘤细胞建议稀释比例为1:8-1:9;

5、将铺好的胶放于37℃的培养箱中,使其充分凝固,笔者在这里更喜欢放置过夜哈,可以让稀释的胶充分凝固;

6、利用无血清的细胞培养液稀释细胞至100μL,加入到小室中,切记上室是无血清的,这样细胞才会向着有血清的下室穿过去;

7、下室加入含有10%血清的培养基600μL,切记下室是有血清的,才会吸引上室无血清的细胞穿过来;

8、放入37度培养箱中进行培养24-72小时,诱导细胞穿下基质胶,培养的时间小伙伴们还得根据自己的实验进行摸索哈,笔者做的胃癌细胞功能测定一般就24小时;

9、取出后,将上室和下室的多余液体吸出,并用PBS清洗上室(200μL),下室(600μL),清洗两遍,注意!多清洗清洗效果更好哈,笔者深有体会;

10、用甲醇或4%多聚甲醛固定15分钟,细胞固定不好,拍照焦头烂额,固定不好的话,小心不好染色呀,笔者亲身经历;

11、用吉姆萨染料或0.5%结晶紫染料进行染色20分钟,小伙伴们根据说明书来哈!;

12、PBS清洗小室3遍,清洗干净后进行拍照(结晶紫染色的话需要33%的醋酸进行脱色),这里的小伙伴们注意啦,如果背景颜色特别深且杂乱,很容易在投稿时被返修及退稿呀,笔者有过相同的经历,因为背景特备深而被返修,如图5;

图5. Transwell实验背景颜色深示意图


13、利用软件Image J进行细胞计数,并做最后的统计。

14、肿瘤细胞迁移实验与侵袭实验不一样在于,迁移实验不用提前铺matrigel胶。

总之,研究肿瘤的功能试验离不开Transwell,虽然是小小的实验,但是每一步都有我们需要注意的地方,这里需要大家注意细节,所谓细节决定成败,最后笔者祝大家实验顺利,文章大发!

相关阅读:

· 懒人神器教你如何细胞计数,告别血平板和计数器

· 细胞荧光怎么定量?快来,又发布高分神器啦!

· 排雷攻略:一文教会你免疫组化、免疫荧光如何制片看片

· 一个值得你了解的肿瘤研究神器

· 老司机带你解锁ImageJ实用技巧(上)

· 老司机带你解锁ImageJ实用技巧(下)

· 不得不知道的 ImageJ 实用插件分享






关注后获取《科研修炼手册》1、2、3、4、5、6、7、8、9、10

    您可能也对以下帖子感兴趣

    文章有问题?点此查看未经处理的缓存