J. Med. Chem.：新型15-脂氧合酶-1抑制剂保护巨噬细胞免受脂多糖诱导的细胞毒性

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导读

格罗宁根大学Frank J. Dekker课题组研究了吲哚核的新取代及其结构−活性关系的研究对于15-LOX-1的抑制。将最有效的抑制剂以264.7巨噬细胞为研究模型探索了对细胞15-LOX-1的抑制作用以及对活性氧形成的影响，以了解这种抑制剂的细胞效力。相关工作发表在J. Med. Chem.上（DOI: 10.1021/acs.jmedchem.9b00212）。

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调节细胞死亡的各种机制包括脂质过氧化物和一氧化氮等氧化介质的形成。在这方面，15-脂氧合酶-1(15-LOX-1)是催化脂质过氧化物生成的关键酶。这些过氧化物的作用与核因子-κb（NF-κb）信号和NO的产生有关，而抑制15-LOX-1可以阻止在炎症条件下的细胞死亡。

NF-κb通路的激活导致下游基因的转录，如在炎症反应中起关键作用的诱导型一氧化氮合酶（iNOS）。iNOS催化NO自由基的形成，而NO自由基在许多生理过程中起着关键作用。另一方面，过量的NO生成会导致活性氮物质（RNOS）的形成，从而导致细胞死亡和组织损伤。活性氧（ROS），如脂质过氧化物，已被证明能增强LPS介导的NF-κb活化，从而增加NF-κb靶基因的表达。15-LOX-1是一种由多不饱和脂肪酸如花生四烯酸(AA)和亚油酸(LA)产生脂质过氧化物的非血红素铁酶。15-LOX-1氧化AA生成相应的15-羟基二十碳四烯酸或氧化LA，生成相应的13-羟基十八碳二烯酸(13-HpODE)。如果细胞抗氧化系统不能平衡脂质过氧化物的产生，这就会导致嗜铁蛋白细胞死亡和NF-κb通路的激活。从而在调节细胞死亡的两种机制之间提供协同串扰。因此，15-LOX-1是许多疾病中氧化应激和调节细胞死亡的关键酶。

（来源：J. Med. Chem.）

Frank J. Dekker课题组研究了吲哚核的新取代及其结构−活性关系的研究对于15-LOX-1的抑制。将最有效的抑制剂以264.7巨噬细胞为研究模型探索了对细胞15-LOX-1的抑制作用以及对活性氧形成的影响，以了解这种抑制剂的细胞效力。

首先，作者对设计的吲哚类似物进行筛选，最终确认化合物9c（i472）是最有效的15-LOX-1抑制剂，IC₅₀值为0.19（Figure 1）。接着，作者进一步研究了抑制剂9c（i472）对细胞LOX活性的抑制作用。作者测试了巨噬细胞内9c对脂氧化酶的抑制作用（Figure 5），结果显示链霉亲和素−辣根过氧化物酶检测到的基于活性的脂氧合酶标记带的强度降低。表明9c能抑制细胞内脂氧合酶的活性。

 Figure 1.IC₅₀ Values against 15-LOX-1 with Different Analogues  （来源：J. Med. Chem.）

（来源：J. Med. Chem.）

之后，作者在细胞基础上研究这种化合物的潜在作用。作者推测15-LOX-1抑制剂可以抑制细胞内脂氧化物的形成，从而阻止嗜热细胞死亡。另外，作者期望这种机制将与NF-κb通路产生串扰。因为NF-κb通路的激活也会导致细胞死亡。作者利用LPS诱导细胞死亡，通过加入15-LOX-1抑制剂来观察细胞存活率，以此来判断抑制剂的效力。结果显示（Figure 7），15-LOX抑制剂Zileuton和先前鉴定的15-LOX-1抑制剂Eeftheriadis-14d可提高LPS处理的264.7巨噬细胞的存活率，而抑制剂9c（i472）表现出更强的活性。

（来源：J. Med. Chem.）

为了进一步观察保护LPS诱导细胞死亡的机制，作者考察了9c对NF-κB通路的影响。用LPS、干扰素γ（IFNγ）和抑制剂9c（i472）刺激细胞。结果显示，9c对LPS/INFγ刺激NF-κb转录激活有显著但不完全的抑制作用（Figure 8）。

（来源：J. Med. Chem.）

iNOS基因转录与NO的产生有关，而NO对免疫应答和凋亡有重要调节作用，作者比较了9c（i472）对264.7巨噬细胞硝酸盐与亚硝酸盐比值的抑制作用（Figure 10）。结果表明，9c（i472）作为一种15-LOX-1抑制剂，对NO的产生具有剂量依赖性的抑制作用，这与NF-κb活性降低和iNOS基因表达的结果一致。

（来源：J. Med. Chem.）

氧化应激通过产生脂氧化物而产生毒性作用，是造成细胞死亡的重要途径。作者在RAW 264.7细胞中测试了9c对脂质过氧化作用的影响，利用荧光染料二吡咯二氟化硼（BODIPY）581/591 C11和荧光激活细胞分类术（FACS）进行观察。结果显示（Figure 11），9c与抑制剂PD-146176在5μM浓度下有相当的减弱脂质氧化物的促进作用。与15-LOX抑制剂Zileuton相比，两种15-LOX-1抑制剂对脂质过氧化均表现出更强的促进作用，虽然15-LOX-1不是唯一能触发脂质过氧化物形成的途径，但这些结果表明对15-LOX-1的抑制对模型系统中的脂质过氧化有很强的影响。

（来源：J. Med. Chem.）

总结：格罗宁根大学Frank J. Dekker课题组将化合物9c（i472）作为一种具有新的取代基型（IC₅₀=0.19μm）的强效15-LOX-1抑制剂，并对其进行了研究。通过基于活性的标记，作者证明了抑制剂9c（i472）能够抑制细胞内的脂氧合酶。该化合物的进一步表征表明，它能够保护264.7巨噬细胞免受LPS诱导的细胞死亡。探讨了抑制剂9c（i472）对不同细胞死亡途径的影响。包括NF-κb的激活、iNOS的表达和NO的形成，这些都是可以触发细胞死亡的一系列因素。结果显示，抑制剂9c（i472）可能通过串扰机制影响NO的产生和脂质的过氧化。

撰稿人：安fen

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