重复一篇WGCNA分析的文章（解读版）（逆向收费读文献2019-19）

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文章发表于2017年11月，是 A novel microglial subset plays a key role in myelinogenesis in developing brain

数据公布在GEO，还提供了表达矩阵：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE78809

cat GSE78809_series_matrix.txt|grep ftp|tail -1|tr '\t' '\n'|tail -n +2|xargs wget -c

可以直接下载表达矩阵去走下游分析，也可以从 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra?term=SRP071039 测序原始数据开始。

背景介绍

大脑中的细胞大致分为两类：神经元（neurons）和神 经胶质细胞（glial cells）。出生后，神经元逐渐延长形成轴突和树突，彼此交联形成复杂的信息交换网络。大脑中50%以上的细胞都是神经胶质细胞，数量上是神经元的3倍。

神经胶质细胞包括在脑和脊髓中的大胶质细胞(星形胶质细胞Astrocyte和少突胶质细胞Oligodentrocyte)、小胶质细胞（microglia）和室管膜细胞（Ependymal cells），周围神经系的神经节卫星细胞（satellite cell）和雪旺细胞（schwann cells）。(是不是一脸懵逼，感觉很受伤，无所谓，不影响本文的WGCNA分析)

小神经胶质细胞（Microglia）作为脑部目前唯一发现的一类免疫细胞，在维护机体的正常状态上起着重要的作用。小胶质细胞作为中枢神经系统的免疫细胞，它的生活方式会受到周围环境的影响，激活状态与微环境相关，激活后的小胶质细胞有M1和M2两种状态，不同状态的小胶质细胞发挥不同的作用。

这里作者区别了 neonatal(新生的) 和 EAE的Microglia，还有CD11C阳性和阴性。

值得一提的是，在单细胞水平研究小神经胶质细胞（Microglia）动态发育和异质性已经有了不少研究。

• 波士顿儿童医院的研究者们分析了超过76,000个来自于发育、衰老和脑部感染后的小鼠脑部的小胶质细胞，结果表明至少有9种转录特异的小胶质细胞形态，它们可以表达特定的基因集，且位于特定的脑区。发表于免疫学杂志Immunity， doi:10.1016/j.immuni.2018.11.004 (2019).

• 斯坦福大学医学院的研究者采用高深度scRNA测序揭示了小胶质细胞和脑髓细胞的发育异质性，发表于Neuron，这些细胞取自于胚胎期、出生后早期和成年的小鼠不同脑区。我们发现大部分的成年小胶质细胞表达稳定的基因（homeostatic genes），且不同脑区间没有差异。相反，出生后早期的小胶质细胞异质性更高。doi:10.1016/j.neuron.2018.12.006 (2019).

• 德国弗莱堡大学医学院神经病理学研究所的研究者采用单细胞RNA测序揭示小鼠和人的小神经胶质细胞的空间和时间异质性，成果最近以Letter的形式发表于Nature杂志。doi:10.1038/s41586-019-0924-x (2019).

数据规律

在GEO界面可以看到是17个样本，分布如下：

• orange represents neonatal CD11c+ microglia (n = 4),

• green neonatal CD11c microglia (n = 4),

• blue EAE CD11c+ microglia (n = 3),

• purple EAE CD11c microglia (n = 3),

• black adult microglia (n = 3).

其实就是 neonatal(新生的) 和 EAE的Microglia，还有CD11C阳性和阴性，然后和成年小鼠的Microglia进行比较。

需要注意的是：Microglial markers (Aif1, Itgam, Cx3cr1, Csf1r)

来自于两个参考文献的  (Butovsky et al, 2014; Bennett et al, 2016)  signature genes ，主要是(Spi1, Irf8,Olfml3, Hexb, Fcrls, Tgfbr1, P2ry12, Siglech, Tmem119)

走WGCNA流程

Co-expression networks were generated for 12,691 genes of the transcriptome dataset.

首先基因分模块：

然后基因形状关联分析：

然后看Module Eigengene (ME) 在不同样本分组的表现：

最后看不同的module的GO/KEGG等数据库的功能注释结果。

走分组比较差异分析流程

这里定义统计学显著upregulated genes (logFC ≥ 1.5; FDR ≤ 0.01) ，多次分组比较后就有多个上下调基因集。

差异分析结束后就可以简单韦恩图展现：

基因集的GO/KEGG等数据库的功能注释结果也可以比较后绘图；

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