大连医科大学：外泌体miR-501是胃癌阿霉素耐药和恶性进展的罪魁祸首
胃癌（GC） 是全球第五大最常见恶性肿瘤和癌症相关死亡的第三大原因。由于缺乏分子标志物，胃癌通常只有在晚期才能被诊断出来，导致五年生存率只有20-30%。胃癌的发生和发展可能由包括遗传学、表观遗传学和环境在内的多种因素引起的。因此，我们需要全面了解潜在的分子机制，才能有助于开发新的胃癌的诊断和治疗方法。
2019年6月5日，大连医科大学基础医学院宋波研究团队、大连医科大学附属第一医院关宏伟研究团队等在Cancer Letters（IF=6.491）杂志上发表文章，文中指出阿霉素耐药的胃癌细胞可以通过外泌体向受体细胞转移miR-501，造成受体细胞中BLID基因下调，从而引起受体细胞产生阿霉素耐药性，并促进肿瘤发展[1]。
实验思路设计：
从细胞培养上清中分离和鉴定外泌体
（超离、透射电镜、纳米粒径、WB等）
确定外泌体中的关键因子，并探索其功能
（qRT-PCR、外泌体荧光标记、CCK-8等）
探究其中的机制，包括靶点和通路
（qRT-PCR、WB、细胞凋亡、CCK-8等）
体内外验证外泌体关键因子能促进受体细胞肿瘤的发展
（细胞增殖、迁移和侵袭、皮下成瘤、瘤内注射等）
1、从胃癌细胞株SGC7901和阿霉素耐药株SGC7901/ADR的细胞培养上清中分离和鉴定外泌体
研究人员分别从SGC7901和SGC7901/ADR两种细胞的培养上清中分离外泌体，通过透射电镜（TEM）方法观察到囊泡的双层膜圆形结构（Fig.1A），再用纳米粒子跟踪分析（NTA）技术检测到囊泡的大小主要在100nm左右，且由SGC7901和SGC7901/ADR分泌的颗粒浓度分别为4.6×108 particles/ml和2.8×109 particles/ml（Fig.1B），随后通过Western blot检测出外泌体蛋白标志物（CD63、CD81和HSP70）的表达（Fig.1C）。这些结果表明SGC7901和SGC7901/ADR能分泌出典型的外泌体，同时耐药SGC7901/ADR细胞分泌的外泌体多于敏感的SGC7901细胞。
Fig.1 来源于胃癌细胞SGC7901和SGC7901/ADR分泌的外泌体特征
2、miR-501在SGC7901/ADR细胞来源的外泌体中富集，并通过外泌体转移以增强SGC7901受体细胞对阿霉素的耐药性
研究人员用qRT-PCR分别检测了SGC7901/ADR和SGC7901细胞来源的外泌体中miR-501的表达水平，结果显示SGC7901/ADR细胞分泌的外泌体（ADR Exo）miR-501含量比SGC7901分泌的外泌体（7901 Exo）miR-501高2.54 ± 0.31倍（Fig.2A），因此作者推断，来自ADR Exo的miR-501可能通过外泌体转移使SGC7901对阿霉素产生耐药性。接着作者将ADR Exo用PKH26进行标记，再将标记好的外泌体与SGC7901共孵育，通过共聚焦拍照发现外泌体能被SGC7901受体细胞成功摄取（Fig.2B）。随后，作者验证了miR-501是否通过外泌体传递。作者将Cy3标记的miR-501转入SGC7901/ADR细胞，并把该细胞置于共培养系统的上室，将SGC7901细胞置于下室。共培养24h后，下室培养的SGC7901细胞能看到有较强的红色荧光（Fig.2C）。此外，与ADR Exo共孵育后，SGC7901细胞中miR-501显著上调（Fig.2D）。上面数据表明miR-501可能通过外泌体直接从SGC7901/ADR供体细胞转移到SGC7901受体细胞。
然后，作者用阿霉素处理与ADR Exo共培养的SGC7901细胞，CCK-8数据显示ADR Exo的存在诱导了SGC7901细胞对阿霉素的耐药性，且呈剂量依赖性（Fig.2E）。阿霉素的半抑制浓度（IC50）增加1.86±0.41倍（7901+ADR Exo vs. 7901+PBS）。miR-501可能通过外泌体从耐药GC细胞转移到邻近的敏感GC细胞，从而诱导对阿霉素的耐药性。
Fig.2 ADR Exo的miR-501水平高于7901 Exo，外泌体miR-501的转移增强了SGC7901受体细胞对阿霉素的耐药性
3、SGC7901/ADR分泌的外泌体miR-501通过靶向BLID使受体细胞对阿霉素产生耐药性
为了证实外泌体miR-501的靶基因是BLID，作者将miR-501 inhibitor（7901 501KD）、阴性对照miRNA inhibitor（7901 NCi）、BLID （7901 BLID）包装到慢病毒中并感染SGC7901细胞，再用嘌呤霉素进行稳转细胞株筛选，接着将ADR Exo分别加入这三种细胞培养基中。结果显示，ADR Exo显著提高了7901 NCi中miR-501表达，但没有增加7901 501KD中miR-501表达（Fig.3A）。同时，相比添加PBS，ADR Exo的添加使7901 NCi 中BLID的mRNA和蛋白水平表达均有所下降。然而，miR-501敲低或BLID过表达消除了ADR Exo诱导的BLID下降（Fig.3B和C）。因此，作者发现ADR Exo能诱导受体细胞中miR-501上调和BLID下调，证实了miR-501能通过外泌体转移并负调控BLID表达的假设。
随后用外泌体分泌抑制剂GW4869处理SGC7901/ADR细胞，想进一步验证miR-501是否通过外泌体传递的。作者观察到添加了GW4869后SGC7901/ADR细胞中的miR-501表达显著降低（Fig.3D），相反地，BLID的mRNA和蛋白水平均明显升高（Fig.3E和F）。这些数据表明miR-501的递送依赖于外泌体，并且外泌体miR-501也下调BLID。
为了确定miR-501是否存在于外泌体中，作者用miR-501 inhibitor转染SGC7901/ADR细胞（ADR 501i），同时采用共转染miR-501 inhibitor和BLID的特异性siRNA（ADR 501i+siBLID）及阴性对照inhibitor（ADR NCi）作为阴性对照组。结果显示7901+ADR 501i中BLID的mRNA和蛋白水平比阴性对照组高。这些结果进一步说明了ADR Exo含有miR-501，并且外泌体miR-501能下调BLID（Fig.3E和F）。
最后，作者评估外泌体miR-501是否通过靶向BLID诱导SGC7901细胞对阿霉素产生耐药性。从Fig. 3G可以得出，miR-501敲低和BLID过表达可逆转ADR Exo对SGC7901细胞产生阿霉素耐药性的影响。相反地，用GW4869处理过的SGC7901/ADR细胞与SGC7901细胞共培养后，会使SGC7901细胞对阿霉素的敏感度增强（Fig.3H），此外，当与miR-501敲低的SGC7901/ADR细胞共培养时，SGC7901细胞对阿霉素的耐药性发生逆转。总之，这些结果表明，外泌体miR-501可能通过抑制GC细胞中的BLID，使其获得阿霉素耐药性。
Fig.3 SGC7901/ADR分泌的外泌体miR-501通过抑制BLID使SGC7901受体细胞获得阿霉素耐药性
除了评估对SGC7901细胞的影响，作者还发现SGC7901/ADR分泌的外泌体miR-501通过靶向BGC823胃癌细胞株的BLID诱导其具有阿霉素耐药性。作者通过慢病毒载体将miR-501 inhibitor（823 501KD）、阴性miRNA inhibitor（823 NCi）、BLID（823 BLID）转入BGC823细胞中，同时向培养基中添加ADR Exo。结果表明ADR Exo能提高miR-501的表达水平，但是降低了823 NCi中BLID的mRNA和蛋白表达水平。上述结果进一步说明了耐药株分泌的外泌体miR-501通过靶向靶细胞BLID，促进细胞形成阿霉素耐药性。
4、外泌体miR-501通过下调BLID并使下游capase通路失活，来抑制细胞凋亡以增强受体细胞中的阿霉素耐药性
作者分别向培养的7901 NCi、7901 501KD和7901 BLID细胞中添加ADR Exo并检测细胞的凋亡速率，同时用7901NCi+PBS做阴性对照。结果发现，7901 NCi+ADR Exo组凋亡速率明显下降，尤其在细胞凋亡早期阶段，而7901 501KD+ADR Exo和7901 BLID+ADR Exo组凋亡速率没有明显变化（Fig.4A和B）。此外，7901+ADR GW4869 和7901+ADR 501i两组相比对照细胞，其凋亡速率明显提高（Fig.4C和D）。这些数据表明miR-501通过外泌体转移下调GC细胞的BLID，从而抑制凋亡。
随后，作者验证BLID是否介导caspase通路的激活，从而诱导细胞凋亡。实验发现，7901 NCi+ADR Exo和823 NCi+ADR Exo两组中caspase-9 和 caspase-3的断裂水平受到抑制，而miR-501 敲低组和BLID过表达组则没有明显变化（Fig.4E）。结果显示，外泌体miR-501/BLID轴通过抑制细胞凋亡（可能通过caspase途径失活），来增强阿霉素的耐药性。
Fig.4 外泌体miR-501通过下调BLID并随后通过caspase-9和-3失活介导的凋亡逃避，诱导SGC7901受体细胞对阿霉素产生耐药性
5、外泌体miR-501靶向BLID并通过Akt磷酸化促进受体细胞增殖、迁移和侵袭
作者接着考察了外泌体miR-501/BLID轴对GC细胞的增殖、迁移和侵袭影响。结果发现，7901 NCi细胞用ADR Exo处理后其克隆形成、迁移和侵袭能力均提高了，而7901 501KD和7901 BLID细胞加了ADR Exo处理后其克隆形成、迁移和侵袭能力没有明显变化（Fig.5A-C）。相反地，SGC7901细胞与ADR GW4869共培养后，其增殖、迁移和侵袭能力都减弱了（Fig.5D-F）。这些结果说明了外泌体miR-501通过靶向BLID提高了GC细胞的增殖、迁移和侵袭能力。
一项研究表明，在乳腺癌中BLID通过抑制Akt通路，从而抑制细胞生长和转移。因此，作者用WB来检测Akt在Ser 473位点的磷酸化（p-Akt Ser 473）。如Fig.5G所示，在7901 NCi+ADR和823 NCi+ADR Exo两组细胞中，p-Akt Ser 473明显提高了，而7901 501KD、823 501KD、7901 BLID和823 BLID 细胞添加了ADR Exo后，p-Akt Ser 473没有明显变化。相反地，在SGC7901/ADR细胞中抑制外泌体分泌（Fig.5H）或miR-501敲低（Fig.5H）都可以抑制Akt在Ser 473位点的磷酸化。这些发现揭示了外泌体miR-501通过下调BLID和Akt的磷酸化来促进GC细胞的增殖、迁移和侵袭。
Fig.5 外泌体miR-501通过下调BLID和Akt的磷酸化来促进SGC7901受体细胞的增殖、迁移和侵袭
6、外泌体miR-501在体内诱导阿霉素耐药性，促进胃癌发生
作者分别将稳定转染的7901 NCi、7901 501KD和7901 BLID三种细胞株通过皮下注射到裸鼠体内，发现7901 NCi的肿瘤生长速度比7901 501KD和7901 BLID的快，而7901 501KD和7901 BLID二者的肿瘤生长速度没有明显差别（Fig.6A）。重要的是，7901 NCi组小鼠瘤内注射ADR Exo后，肿瘤生长明显快于PBS组，而7901 501KD+ADR Exo组、7901 BLID+ADR Exo组和7901 NCi+PBS组间无明显差异（Fig.6B）。此外，经阿霉素处理后，7901 NCi+ADR Exo组的肿瘤体积明显大于7901 NCi+PBS组，而7901 NCi+PBS+ADR、7901 501KD+ADR Exo+ADR、7901 BLID+ADR Exo+ADR三组之间无明显差异（Fig.6C和D）。这些结果阐释了ADR Exo可促进体内SGC7901细胞的生长并诱导其产生阿霉素的耐药性。
然后，作者在小鼠异种移植瘤组织中检测了miR-501水平及其靶蛋白BLID的mRNA和蛋白表达水平。如Fig.6E和F所示，与7901 NCi+PBS+ADR组相比，7901 NCi+ADR Exo+ADR组的miR-501水平升高，BLID mRNA水平和蛋白表达下降。相应地，7901 NCi+ADR Exo+ADR组的肿瘤组织中caspase-9和caspase-3的断裂受到抑制及Akt在Ser 473位点的磷酸化水平升高了（Fig.6G）。这些数据表明在体内外泌体转移miR-501可以通过下调BLID和随后的caspase-9/-3失活及AKT磷酸化来提高SGC7901受体细胞的阿霉素耐药性和生长速度。
Fig.6 外泌体miR-501在体内能诱导胃癌细胞产生阿霉素耐药性，并且能提高胃癌细胞的致癌作用
根据上述结果，作者提出了一个外泌体miR-501在胃癌细胞中的潜在功能模型（Fig.7）。由SGC7901/ADR细胞分泌的含有miR-501的外泌体可被受体细胞吸收，从而增强受体细胞的恶性表型，包括阿霉素耐药性、增殖能力、迁移与侵袭能力。这种增强可能是通过抑制BLID和随后的caspase-9/-3失活以及Akt磷酸化实现的。
Fig.7 外泌体miR-501在胃癌中的潜在功能
结论
文章中通过对耐药株分泌的外泌体进行分离、鉴定、示踪及与受体细胞共培养，发现耐药株外泌体中的miR-501通过靶向受体细胞的BLID，使其下游capase通路失活，从而提高受体细胞的阿霉素耐药性。同时，外泌体miR-501靶向BLID也能促使肿瘤的发展。
参考文献：
[1] Liu X, Lu Y. et al. Exosomal transfer of miR-501 confers doxorubicin resistance and tumorigenesis via targeting of BLID in gastric cancer. Cancer Lett. 2019 Jun 5;459:122-134.