【Nat. Neurosci.】您还在害怕社交吗？空军军医大学武胜昔研究组揭示社交恐惧的罪魁祸首！

社交行为，是指在一定的历史条件下，个体之间相互往来，进行物质、精神交流的社会活动，对个体及种群的生存与繁衍至关重要。社交行为需要感觉、奖赏、认知、情绪等多种信息的处理[1-3]，当这些信息无法正确处理并整合，则会引起社交障碍。社交障碍是自闭症谱系障碍（ASD）的核心临床表现之一，但相应神经学机制并不清楚。

图片来源：autism after 16

过去研究表明，前扣带皮层（ACC）参与多来源社交信息的整合，并与多种社交信息处理相关脑区产生功能性连接[1, 4, 5]。因此，社交障碍的产生，很可能与ACC脑区的功能紊乱有所关联。 

ACC的位置

图片来源：Wikipedia

另有研究显示，Shank3基因突变会引发机体产生ASD相关症状[6]。其蛋白SHANK3是一种兴奋性突触后支架蛋白，与多种突触后致密物蛋白相互作用，对突触后受体、分子信号正常功能的行使十分重要[6]。敲除Shank3基因导致小鼠产生ASD相关行为，包括刻板行为、社交障碍等等，而在Shank3缺陷小鼠中再表达Shank3可缓解上述行为[7]。然而，对于Shank3基因在哪个脑区中行使功能，我们尚未可知。

SHANK3蛋白结合多种突触后蛋白 

图片来源：Bentham Science

2019年7月23日，《Nature Neuroscience》杂志在线刊登了空军军医大学武胜昔研究组的最新重要工作[8]，他们发现ACC锥体神经元中Shank3基因与小鼠正常社交行为密切相关，Shank3基因的敲除通过弱化兴奋性输入以降低神经元活性，进而诱发社交障碍。该研究揭示了参与社交障碍的基因、脑区及其相关机制，极大提高了人们在社交行为领域中的认知。

武胜昔教授

图片来源：ResearchGate

结果

1

缺乏SHANK3改变ACC锥体神经元的形态

首先，作者通过荧光原位杂交方法探究ACC中Shank3的表达，发现Shank3主要表达于锥体神经元（图1a-c）。接着，为研究Shank3敲除对ACC锥体神经元的影响，作者在眼眶注射AAV-hSyn-EGFP或在ACC注射塞姆利基森林病毒以稀疏标记ACC神经元，发现Shank3 KO小鼠ACC锥体神经元树突复杂度降低，其蘑菇型树突棘数量与树突棘总数量均显著减少（图1d-j）。此外，电镜结果显示，Shank3 KO小鼠ACC神经元突触后致密物的长度与厚度均显著降低（图1k-m）。以上结果表明，敲除Shank3导致ACC锥体神经元的树突产生形态学缺陷。

图1 Shank3 KO小鼠ACC脑区的形态学变化

2

缺乏SHANK3改变ACC锥体神经元的突触功能

形态学后，便是功能学。为探究上述形态学变化带来的功能学影响，作者使用膜片钳电生理方法全细胞记录ACC锥体神经元，发现Shank3 KO小鼠ACC锥体神经元由AMPA受体介导的微小兴奋性突触后电流（mEPSC）的频率与幅度均显著降低（图2a-b），电刺激诱发的EPSC幅度与AMPA/NMDA ratio（AMPA受体介导的EPSC幅度和NMDA受体介导的EPSC幅度的比值，此比值与突触可塑性相关）均显著减小（图2c-f）。而且，配对训练范式不能诱发Shank3 KO小鼠ACC锥体神经元产生LTP（图2g-h），表明敲除Shank3弱化了ACC锥体神经元的兴奋性输入。 

图2 Shank3 KO小鼠ACC锥体神经元兴奋性突触功能紊乱

3

缺乏SHANK3导致ACC锥体神经元活性降低

那么，兴奋性输入弱化带来的又是什么呢？咱们继续看。作者使用电流钳记录ACC锥体神经元，发现Shank3 KO小鼠ACC锥体神经元需要更强的刺激才能产生动作电位（图3a-c）。行为学方面，他们使用光纤钙信号记录方法实时监测ACC活性，发现Shank3 KO小鼠社交时ACC活性显著低于正常小鼠（图3d-h）,表明Shank3 KO小鼠ACC神经元较难被激活。 

图3 社交过程中Shank3 KO小鼠ACC神经元反应较弱

4

ACC中条件敲除Shank3基因诱发社交障碍

为进一步探究ACC神经元中Shank3基因与社交行为的关联性，他们通过AAV在小鼠ACC中选择性敲除Shank3基因（图4a-d），发现ACC锥体神经元mEPSC幅度和频率显著降低，电刺激激活的EPSC幅度与AMPA/NMDA ratio也显著减小，与Shank3 KO小鼠结果一致（图4e-l）。行为学方面，作者引入社交三箱范式，借以表征小鼠的社交偏好性。他们发现ACC中条件敲除Shank3基因的小鼠表现为严重的社交障碍，与陌生鼠的接触时间以及在含陌生鼠箱子中的逗留时间均显著减少（图4m-q），表明单独在ACC中条件敲除Shank3基因即可充分诱发小鼠社交障碍。 

图4 ACC中条件敲除Shank3基因弱化兴奋性输入并引发社交障碍

5

光激活ACC改善Shank3敲除鼠的社交行为

上文已知，ACC脑区敲除Shank3基因降低锥体神经元活性并诱发社交障碍，那么锥体神经元活性的降低与社交障碍的产生是否具有关联性呢？若有，激活ACC理应恢复小鼠正常的社交行为。

为验证此假设，作者在ACC中注射AAC-CaMKII-ChR2，以高于生理状态下ACC锥体神经元发放水平的频率激活这些神经元，发现Shank3 KO小鼠社交行为显著上升，无论是在三箱范式中面对素昧平生的成年鼠，还是在鼠笼中面对人畜无害的幼年鼠（图5a-k），表明Shank3敲除鼠的社交障碍由ACC锥体活性降低所致，因此激活这些神经元可改善小鼠社交行为。此外，光激活ACC锥体神经元具有抗焦虑作用,小鼠在高架十字迷宫开放臂的逗留时间增长，运动距离也增加（图5l-m）。 

图5 光激活ACC改善Shank3敲除鼠的社交行为及焦虑行为

6

选择性恢复Shank3敲除鼠ACC中Shank3的表达缓解小鼠社交障碍

为进一步探究ACC锥体神经元中Shank3基因在社交行为中的功能，作者在Shank3 CKI小鼠的ACC中注射AAV-CaMKII-Cre以选择性恢复ACC锥体神经元中Shank3基因的表达[7]（图6a-c），发现ACC锥体神经元mEPSC频率部分恢复，而mEPSC幅度、电刺激引发的EPSC幅度与AMPA/NMDA ratio均恢复至正常水平（图6d-k）。行为学方面，在ACC锥体神经元中恢复Shank3基因的表达可在一定程度上缓解社交障碍（图6i-p），表明ACC锥体神经元中Shank3基因的表达与正常社交行为密切相关。 

图6 恢复Shank3 KO鼠ACC Shank3表达缓解小鼠社交障碍

7

药理学激活AMPA受体恢复Shank3 KO小鼠社交

上文已知，AMPA受体缺陷是Shank3 KO小鼠ACC活性降低的重要原因，于是作者探究恢复AMPA受体活性是否可以缓解社交障碍。他们在小鼠皮下注射AMPA受体别构调节物CX546，发现AMPA受体介导的电流的幅度与持续时间均显著增加（图7a-d）。接着，他们在Shank3 KO小鼠中以3种不同剂量皮下注射CX546，发现中高剂量注射可改善小鼠社交行为（图7e-h）。此外，ACC锥体神经元mEPSC的频率与幅度、电刺激引起的EPSC幅度和AMPA/NMDA ratio均显著上升，配对脉冲比不变（图7i-p），表明CX546作用于突触后而非突触前，增加AMPA受体活性可恢复Shank3 KO小鼠社交行为。 

图7 药理学激活AMPA受体恢复Shank3 KO小鼠社交行为

总结

社交行为需要多种信息的处理与整合，对个体及种群的生存与繁衍至关重要。社交障碍是自闭症谱系障碍（ASD）的临床表现之一，解析参与社交障碍的相关脑区及其神经学机制，可为ASD相关药物的研发提供靶点。过去研究表明，Shank3基因与社交行为密切相关，但其作用的脑区及相关神经学机制，我们知之甚少。本篇文章结合形态学、电生理、光遗传学、基因敲除与再表达等多种方法发现ACC锥体神经元中Shank3基因对正常社交行为至关重要，敲除Shank3基因弱化ACC锥体神经元活性，导致小鼠产生社交障碍，恢复ACC锥体神经元中Shank3基因的表达、提高ACC锥体神经元中AMPA受体的活性以及直接光激活ACC锥体神经元均可缓解上述症状。这项研究阐释了参与社交行为的基因、脑区及其相应神经学机制，为临床治疗ASD相关疾病提供有力支持！

空军军医大学通过电生理、光遗传学、基因敲除与再表达等技术手段阐释参与社交障碍的基因、脑区及其神经学机制。和元病毒库中有丰富多样的病毒载体，其中包含文中所用多种相关病毒，质量严格把关，经由多实验组验证，欢迎大家选购！

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参考文献

[1].Apps, M.A., M.F. Rushworth, and S.W. Chang, The Anterior Cingulate Gyrus and Social Cognition: Tracking the Motivation of Others. Neuron, 2016. 90(4): p. 692-707.

[2].Dolen, G., et al., Social reward requires coordinated activity of nucleus accumbens oxytocin and serotonin. Nature, 2013. 501(7466): p. 179-84.

[3].Gunaydin, L.A., et al., Natural neural projection dynamics underlying social behavior. Cell, 2014. 157(7): p. 1535-51.

[4].Holroyd, C.B. and N. Yeung, Motivation of extended behaviors by anterior cingulate cortex. Trends Cogn Sci, 2012. 16(2): p. 122-8.

[5].Chang, S.W., J.F. Gariepy, and M.L. Platt, Neuronal reference frames for social decisions in primate frontal cortex. Nat Neurosci, 2013. 16(2): p. 243-50.

[6].Durand, C.M., et al., Mutations in the gene encoding the synaptic scaffolding protein SHANK3 are associated with autism spectrum disorders. Nat Genet, 2007. 39(1): p. 25-7.

[7].Mei, Y., et al., Adult restoration of Shank3 expression rescues selective autistic-like phenotypes. Nature, 2016. 530(7591): p. 481-4.

[8].Guo, B., et al., Anterior cingulate cortex dysfunction underlies social deficits in Shank3 mutant mice. Nat Neurosci, 2019. 22(8): p. 1223-1234.