谁来调控我感兴趣的lncRNA/circRNA/miRNA | 100%可行的解决方案V2.0
耐心读完，消化，实践，修炼成转录调控专家。
第一篇解决的问题：
转录因子调控了谁？本质是蛋白质对DNA的调控。此处"DNA"包括能够翻译成蛋白质的蛋白编码基因、能够转录成lncRNA/circRNA/miRNA的基因
第二篇解决的问题：
谁来调控我感兴趣的基因？本篇从转录水平研究。本质是蛋白质/RNA对DNA的调控。下篇重点讲转录后水平的研究方案。
谁来调控我感兴趣的DNA？100%可行的全面解决方案V2.0
这篇要解决的问题：
ncRNA向下调控了谁？
转录水平，ncRNA基因受谁调控
转录后，ncRNA受谁调控
本质是RNA对DNA/RNA/蛋白质的调控、蛋白质对RNA的调控。人们发现了大量非编码RNA（ncRNA）具有调控作用，本文ncRNA包括lncRNA、circRNA、miRNA
研究lncRNA/circRNA/miRNA的功能，做KO/KD/过表达，看到了表型。然后呢？如何给我的研究拔个高？要升华，就要探讨其作用机制，无非是谁调控了ncRNA，ncRNA向下调控了谁。
RNA向下调控了谁？
基于高通量实验筛选
经典策略是，KD/KO或过表达感兴趣的RNA，通过RNA-seq/蛋白质组实验找出的差异基因/差异蛋白质很可能受该RNA调控。哈尔滨工业大学王亚东组基于这个原理建立了lncRNA2Target数据库，www.lncrna2target.org/，可惜三年没更新了。
它没更新没关系。具体到某个RNA，我们自己去SRA数据库查询RNA-seq数据，如果已经做过这个RNA的KD/KO样品的RNA-seq，就可以拿来看该RNA调控的靶基因了。
上面找到的是间接调控，要直接调控的线索，怎么找？
找RNA直接调控的靶基因的最好方法是ChiRP实验，为RNA设计探针，拉它结合的DNA/RNA/蛋白质。提取DNA，测序，找的是RNA结合的DNA；提取蛋白质，做质谱MS，找的是RNA结合的蛋白；提取RNA，测序，找的是RNA结合的RNA。世界上有几个组能做好ChiRP实验？一只手都数的过来。可行性低，怎么办？预测缩小范围，然后用一对一的实验验证。
预测RNA结合的蛋白质
先用预测方法找出候选基因，然后用低通量实验验证。2017年发表的基于机器学习的RNA和蛋白结合预测工具——catRAPID。http://service.tartaglialab.com/page/catrapid_group，能预测RNA结合的蛋白质，还能预测蛋白质结合的RNA（文末讲这个问题）。用法查看tutorial，简单易用。
支持多个物种
谁来调控lncRNA/circRNA/miRNA的问题，要从转录和转录后两个水平来研究。
lncRNA/circRNA的转录水平调控
（蛋白质结合DNA）
上篇讲的研究转录因子对DNA的调控的方法，同样适用于lncRNA/circRNA/miRNA的研究。这段DNA下游基因要么转录成mRNA然后翻译成了蛋白质，要么转录成lncRNA或circRNA或miRNA。因此，找蛋白编码基因和找lncRNA/circRNA/miRNA基因上游的调控因子的方法是一样的。
Plan A：大量ChIP-seq公共数据
Plan B：motif分析预测
补充Plan C：ATAC-seq结合motif分析
返回上一篇看Plan A和Plan B，谁来调控我感兴趣的DNA？
Plan C：ATAC-seq结合motif分析
调控蛋白所结合的DNA附近会形成open区域，产生DHS。2013年，Howard Y Chang发明了ATAC-seq。详见从第一篇文章开始，讲讲ATAC-seq能干啥？类似于DNase-seq，ATAC-seq能够找出基因组上的open区，根据这段区域上的motif，推测它上面可能结合的TF。ATAC-seq用的细胞数更少，500-50,000个细胞就能做，实验更稳定。有了ATAC-seq的加入，把motif预测出来的候选TF范围缩小到染色质开放区域，结果更准确。
去年Howard Y Chang又发明了ATAC-see（assay of transposase-accessible chromatin with visualization，利用可视化检测转座酶易接近的染色质）。
还记得Howard Y Chang吗？美帝国自然NIH资助啥？一文中看到，他凭《lncRNA在癌症中的作用机制》一项拿到$724,705，相当于人民币400多万，该项目已经发表2篇paper，一篇Single cell，一篇CRISPR screen。我们站在大牛肩上，紧跟大牛节奏，就能赶在上升期，抓紧时间轻松发一区；否则，邻居大妈都知道ATAC-seq的时候。。。
ncRNA的转录后调控
（RNA结合RNA、蛋白质结合RNA）
RNA调控RNA
本来miRNA要退二线，结果lncRNA经常请它出山；现在circRNA加了一把力，让miRNA出镜率又高了起来。发展了这么多年，直接筛选与RNA结合的RNA的高通量实验技术难度依然很大，因此，大家喜欢先预测，再用低通量实验验证。
通过预测miRNA靶基因，筛选作为ceRNA竞争miRNA的lncRNA/circRNA。这种帖子已经满天飞。review总结的ceRNA数据库，https://doi.org/10.1093/bib/bbx042
小哈只说一点，如果做miRNA靶基因预测，首选TargetScan。由专做miRNA的大牛Bartel组开发，持续维护更新，最新更新到2016年6月。提供人、小鼠、线虫、果蝇、斑马鱼的独立检索页面和下载。其余的工具已经很久不更新了，例如pictar用的还是hg18，miRanda更新到2010年。
蛋白质调控RNA
依旧是先讲基于高通量实验的筛选方法，再谈预测方法。
基于高通量实验的筛选调控RNA的蛋白质
什么样的蛋白质会来调控RNA呢？有一类RNA结合蛋白（简称RBP），它们会结合RNA，调控RNA加工。目前发现的人类RBP有1072个。
单独做一套RNA结合蛋白的RIP-seq或CLIP实验，能看到该RBP的靶基因是谁，motif长啥样。少数专门研究RBP的人对这样的问题感兴趣。
上面是模式图，下面是真实数据
更多的研究者想知道：哪个RBP调控了我感兴趣的ncRNA。这就需要多套RIP/CLIP数据整合分析了。当你手里有成百上千套RIP-seq或CLIP-seq数据时，就看哪套数据在感兴趣的RNA上有peak，也就知道了哪个RBP结合了我的RNA。
上面是模式图，下面是真实数据
有哪些RBP的高通量数据可以用呢？
曾经有个收录RBP的数据库RBPDB，http://rbpdb.ccbr.utoronto.ca/，五年没更新了。
所幸ENCODE已经产生了332套高质量的eCLIP-seq数据，包含250个RBP，2种细胞系，存储在ENCORE数据库中。点击左下角“阅读原文”直达eCLIP-seq数据检索界面。
下面的视频由ENCODE里面主攻RBP的Yeo Lab的Eric Van Nostrand讲解。介绍了RBP数据库里都有哪些数据；eCLIP-seq数据处理pipeline和命令行；以及用RBP数据库能做哪些研究？
https://v.qq.com/txp/iframe/player.html?vid=l0546b2m1us&width=500&height=375&auto=0
前面和后面的部分截图来自ppt，需要ppt文件就发消息给嘉因小二。
长按下图，识别二维码，联系嘉因小二
ENCORE数据库里有哪些数据？
eCLIP-seq数据处理pipeline
ENCODE只产生了332套eCLIP-seq数据，在SRA上能检索到更多的RIP-seq和CLIP-seq数据，人的有1890条记录。充分利用这些公共数据，将为研究lncRNA/circRNA调控机制提供有实验证据的线索。
预测调控RNA的蛋白质
积累越来越多的RBP RIP-seq或CLIP数据，识别motif，以后我们也可以通过motif预测的方式找调控RNA的RBP了。目前已有机器学习方法计算Global Score，已经整合进catRAPID工具中，http://service.tartaglialab.com/page/catrapid_group，预测哪个RBP调控我感兴趣的ncRNA。
写到这里，意犹未尽。本系列主要集中在高通量实验筛选，而不是一对一的研究。过后根据读者反应再做补充。有不足之处，请留言指正。
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