【成功案例】百迈客小RNA测序助力lncRNA NEAT1抑制鼻咽癌转移和放疗抵抗的ceRNA机制研究
英文题目：Long non-coding RNA NEAT1 regulates epithelial membrane protein 2 expression to repress nasopharyngeal carcinoma migration and irradiation-resistance through miR-101-3p as a competing endogenous RNA mechanism
中文题目：lncRNA NEAT1作为ceRNA竞争性结合miR-101-3p调控EMP2表达，从而抑制鼻咽癌的转移和放疗抵抗
发表杂志：Oncotarget（2017）
影响因子：5.168
合作单位：四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室
研究背景
鼻咽癌（NPC）是最常见的起源于头部和颈部的癌症，是全球癌症死亡的第三大癌症。NPC具有强烈的种族和地域倾向，我国南方NPC的年发病率约占全国的80%、全世界的65%。鼻咽癌的主要治疗方法是放射治疗，有时会结合化疗。然而，放疗抵抗仍然是晚期NPC治疗的主要障碍。目前还不清楚NPC的放疗抵抗和转移复发的具体机制。因此，迫切需要研究和鉴定鼻炎癌新的预后生物标志物和治疗靶点。
NPC的发生与基因和表观遗传的改变紧密相关，如单核苷酸多态性（SNPs）、DNA甲基化、microRNA（miRNA）和长链非编码RNA （lncRNA）等。其中，lncRNA的功能紊乱也会导致基因调控异常，并导致鼻咽癌及其它肿瘤的发生、发展、转移、耐辐射性和耐化疗性，如HOTAIR、ANRIL、MALAT1等。最近，发现了lncRNA的一种新的调控机制，即通过竞争性结合miRNA，实现与mRNA之间的互作。然而，lncRNA差异表达及其调控网络在NPC的发生、转移和抗辐射方面的详细生物学功能和临床意义尚不清楚，尤其是目前还没有关于lncRNA与NPC抗辐射之间关系的报道。
在这篇文章中，研究者通过分析NPC芯片试验数据、目的lncRNA过表达和敲除试验、小RNA测序试验等，探究了lncRNA--NEAT1参与NPC的机制，是深入了解lncRNA的功能和调控机制的重要一步，并提供了对NPC细胞的抗辐射和迁移过程中NEAT1和EMP2互作的新见解，NEAT1靶向疗法（单独或结合放疗）可以在未来成为针对NPC的诊断和治疗的潜在疗法。
研究方法
• NPC组织芯片数据分析—筛选目的lncRNA NEAT1
• 小RNA测序—筛选目的小RNA
• 双荧光素酶报告试验、pull down试验—分析ncRNA之间、ncRNA与基因之间的结合互作
• 目的基因免疫染色试验、qPCR—分析基因在不同样本中的表达水平
• 过表达、沉默目的RNA：siRNA干扰沉默NEAT1、过表达NEAT1，miR-101-3p mimics和inhibitors等，转染细胞—分析目的RNA功能
• MTT试验、克隆形成试验、细胞划痕实验、流式细胞术—分析肿瘤细胞的生长、增殖、迁移与凋亡
• 鼻咽癌异种移植试验—分析目的RNA的体内作用效果
研究结果
1.目的lncRNA筛选
基于GEO数据库中检索和下载3组NPC组织芯片的原始数据，进行差异表达分析，筛选到10个差异表达的lncRNA（图1A）。综合考虑后选择NEAT1作为后续研究的目的lncRNA，它在3组NPC组织的表达情况见图1B、C、D，与正常组织相比，NEAT1在肿瘤组织中表达量较低。NEAT1表达水平与淋巴结转移、肿瘤分期的相关性分析表明，NEAT1的表达与淋巴结转移更相关（图1E-1H）。
基于更多的NPC数据，分析了NEAT1表达与临床病理参数的相关性，结果表明NEAT1表达与晚期肿瘤分期无显著相关性（图2A）；NEAT1表达水平较高的患者生存时间更长（图2B），说明NEAT1的低表达与不良预后相关。
为了验证NEAT1在NPC组织中是否有差异表达，作者通过qPCR检测了30个NPC组织和10个癌旁组织中NEAT1的表达水平。与预期相同，相比于正常对照组，NPC组织中NEAT1表达明显减少（图2C）。与正常鼻咽上皮细胞NP69相比，NPC细胞系（5-8F、CNE1、CNE2、S26、HNE1、SUNE1、HONE1）中NEAT1表达水平较低。这些数据表明，在NPC病变和发展过程中，NEAT1的表达量下调可能起重要作用。
2.NEAT1在NPC细胞中的作用
为了探讨NEAT1在NPC细胞中的作用，用siRNA-1#、siRNA-2#和siRNA-1#+2#瞬时转染CNE2和HNE1 NPC细胞。因为siRNA-1#比siRNA-2#有更好的沉默效果（图3A-3B），后续使用siRNA-1#进行进一步的试验。划痕实验（wound healing assay）结果表明，NEAT1的低表达导致了两种细胞系的迁移明显加快、敲低组的划痕边缘间距相对于si-NC对照组减少30%（图3C-3E）。MTT试验表明，NEAT1对细胞生长没有明显的影响（图3F-3G）。综上所述， NEAT1强烈抑制了迁移，但对细胞增殖没有明显的影响。
3.NEAT1对NPC细胞辐射敏感性的影响
为了确定NEAT1是否能提高NPC细胞的辐射敏感性，对沉默了NEAT1的CNE2和HNE1细胞进行克隆形成试验（colony formation assays），结果表明在NPC细胞中，NEAT1可以显著提高辐射敏感性（图4A-C）。作者进一步通过流式细胞术检测细胞凋亡，结果表明，在CNE2细胞中，si- NEAT1联合4 Gy辐射处理可显著抑制早期和晚期细胞凋亡（图4D-E）。
4.NEAT1的靶向miRNA筛选
研究表明，lncRNAs可以作为一个“分子海绵”来调节miRNA的积累，进而影响其生物学功能。作者通过miRNA测序筛选与NPC相关的miRNA，通过两种软件预测与NEAT1可能结合、互作的miRNA。此外，作者还结合了qPCR试验，最终筛选出了6个候选miRNA（图5A）。后续选择miR-101-3p进一步研究。为了确认两者之间的结合互作关系，在突变体中进行了双荧光素酶报告试验（dual-luciferase reporter assay）和pull down试验，结果表明miR-101-3p可以直接在miRNA识别位点上与NEAT1结合。
5.NEAT1可以增强辐射敏感性，并受miR-101-3p抑制
虽然miR-101-3p与NEAT1之间的相互作用已得到证实，但miR-101-3p和NEAT1调控的NPC细胞的生物学行为仍需确定。MTT和克隆形成试验结果表明，在辐射条件下，NEAT1过表达会降低相对光吸度和克隆数量，而同时过表达miR-101-3p会逆转这种下降趋势（图6B-D）。进一步通过流式细胞术检测细胞凋亡的结果表明，在辐射条件下，NEAT1过表达会促进细胞凋亡，而同时过表达miR-101-3p可在一定程度上解除这种促进作用（图6E-F）。综上所述，NEAT1可以增强辐射敏感性，而miR-101-3p则可与NEAT1竞争。
6.miR-101-3p的靶基因分析
已有研究表明EMP2是NPC细胞中潜在的抑癌基因。因此，作者通过qPCR检测NPC组织与正常鼻咽上皮细胞组织中miR-101-3p和EMP2表达水平（图7A、B），miR-101-3p对NPC组织中的EMP2起负调控作用，在正常鼻咽上皮组织中两者表达量不相关。NPC组织和癌旁组织中EMP2免疫染色试验结果表明，癌旁组织中EMP2阳性细胞的数量明显高于NPC癌组织（图7C）。双荧光素酶报告试验结果表明EMP2具有一个miR-101-3p的结合位点（图7D-E）。这些结果提示，上调miR-101-3p可以抑制EMP2表达。此外，miR-101-3p mimics和inhibitors转染细胞后，EMP2表达水平分别下调和上调。综上结果，EMP2是miR-101-3p的靶基因。
7.miR-101-3p通过靶基因EMP2参与NPC细胞增殖和迁移
为了检验miR-101-3p对细胞增殖和迁移的影响是由EMP2介导的，作者进行了克隆形成试验、划痕试验及流式技术检测细胞凋亡试验，结果表明miR-101- 3p mimic促进NPC细胞克隆形成和迁移，而EMP2可以逆转这种趋势；4 Gy辐射条件下，miR-101-3p mimic显著抑制CNE2细胞凋亡，而同时过表达EMP2则促进细胞凋亡（图8A-C）。另外，经miR-101-3p mimic转染CNE2细胞后，EMP2的表达水平降低， E-cadherin、N-cadherin、vimentin和MMP-2也会受到影响（图8D）。这些结果表明，NPC中，miR-101-3p的肿瘤促进作用在一定程度上是通过负调控EMP2表达实现的。
8.NEAT1通过靶向miR-101-3p促进体内NPC辐射敏感性
为了验证NEAT1在鼻咽癌异种移植模型的体内效果，将OE - NEAT1、OE - NEAT1+miRNA-101-3p、Sh- NEAT1的CNE2细胞皮下注射到裸鼠，移植瘤在第1、5、9、13天接受4 Gy辐照，测量肿瘤体积和重量，处死后剥离瘤体称重（图9A-C）。结果表明敲除NEAT1明显增加了体内NPC抗辐射能力，而NEAT1的过表达抑制了肿瘤的生长，而增加miR-101- 3p则会逆转这一效应。qPCR试验结果表明，miR-101-3p可以抑制NEAT1的表达（图9D）。为了进一步证实NEAT1促进辐射敏感性效应，分别进行Ki67、EMP2和TUNEL免疫荧光染色试验，结果表明NEAT1可以促进细胞凋亡、抑制增殖，而miRNA-101-3p会逆转NEAT1的这些作用（图9E）。综上所述，NEAT1过表达可以通过靶向miR- 101-3p提高NPC细胞在体内的辐射敏感性。
---- 小结 ----
本篇文章中，作者围绕基因与非编码RNA的ceRNA调控机制，探究了lncRNA NEAT1通过ceRNA调控网络机制，直接作用于miR-101-3p，进一步调控靶基因EMP2表达，进而抑制鼻咽癌细胞的转移和抗辐射，此研究为NEAT1的ceRNA机制对鼻咽癌的转移和抗辐射的调控机制提供了新的见解，并将其作为一种新的预后转移风险和辐射敏感性的生物标志物。此研究中发现了NEAT1通过调节miR-101-3p和EMP2发挥之前未被探索的功能，NEAT1高度参与鼻咽癌的抗辐射性和转移复发的调控。NEAT1正常化（normalization）疗法和放射治疗相结合可能成为一种针对NEAT1缺陷的鼻咽癌患者的新颖、有前景的治疗方法。
参考文献
Wang Y, Wang C, Chen C, et al. Long non-coding RNA NEAT1 regulates epithelial membrane protein 2 expression to repress nasopharyngeal carcinoma migration and irradiation-resistance through miR-101-3p as a competing endogenous RNA mechanism[J]. Oncotarget, 2017, 8(41):70156.