ONT全长转录组测序系列一：初识篇

ONT全长转录组测序

ONT全长转录组测序是指基于牛津纳米孔公司（Oxford Nanopore Technologies，ONT）三代测序平台进行全长转录组测序。

全长转录组测序（full-length transcriptome sequencing），又称为Isoform Sequencing（Iso-Seq），无需打断，基于三代测序平台直接获取转录本的5ˊ到3ˊ高质量全长序列，可准确识别可变剪接、基因融合、可选择性多聚腺苷酸化APA、等位基因特异性表达等转录本结构方面变异。基于nanopore三代测序平台进行全长转录组测序，除了可准确鉴别上述转录本结构变异，还可实现转录本（mRNA或polyA+ lncRNA）表达水平准确定量。

ONT测序技术简介

ONT测序是独一无二的基于电信号识别碱基序列的三代测序技术。DNA/RNA上不同碱基化学性质存在差异，当单链分子通过纳米孔通道时，碱基造成的阻碍大小不一，因此会形成特征性离子电流变化信号。通过对这些信号进行实时检测，即可获得相应碱基类型，完成测序。目前通过“递归神经网络（Recurrent Neural Network）”的复杂算法对碱基进行判读。

ONT测序技术具有以下特点：

1）读长长，最长读长能达到2 Mb以上级别^[1]，有利于可变剪接、基因融合等结构变异检测；

2）低成本：相比其他三代测序技术，ONT测序样本处理极其简单，无需DNA聚合酶、连接酶和dNTPs，测序价格低；

3）可不进行PCR扩增，避免二代测序中PCR扩增可能引入的错误或丰度变化；

4）RNA/DNA-direct方式建库，可直接读取碱基修饰信息，如甲基化修饰5mC、6mA等，无须像二代测序需要经过重硫酸盐转化或者免疫沉淀富集实验；

5）无GC含量和碱基偏好性，转录本表达定量准确。

ONT全长转录组测序实验流程

按照Oxford Nanopore Technologies(ONT)公司提供的标准protocol执行，包括样品质量检测、文库构建、文库质量检测和文库测序等流程，以cDNA-PCR方式进行展示。

ONT全长转录组测序应用

没错，除了普通RNA-seq常进行的基因水平表达研究外，ONT全长转录组测序由于无需打断可以获得全长转录本序列，无GC含量和片段长度偏好性，其在转录本水平的定量更准确，且转录本层面的各种结构变异统统拿下！详见下图：

百迈客ONT全长成功案例

百迈客至今已积累了丰富的项目经验，全长转录组合作文章先后发表在《Plant Biotechnology Journal》、《Biotechnology for Biofuels》、《Journal of Hazardous Materials》、《Scientific Reports》和《Fish & Shellfish Immunology》等国际知名期刊，据不完全统计，百迈客三代全长转录组成功案例累计发表13篇，是国内发表全长转录组成功案例最多的公司，已发表文章研究物种覆盖林木、哺乳动物、昆虫、水产、中药和作物等领域。

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百迈客平台&资质

nanopore平台全面：百迈客自2015年率先引进PacBio三代测序平台，2018年8月又与牛津纳米孔公司达成长期合作，拥有MinION、GridION X5和PromethION三种型号全套纳米孔测序仪，目前有3台PromethION，是国内最多拥有最多PromethION平台的公司；

ONT产品类型丰富：基因组、重测序、甲基化、全长和微生物16S全长及宏基因组等，各个方向产品类型丰富；

ONT RNA测序资质：百迈客是中国大陆首家且唯一一家推出ONT全长转录组测序的公司。中国大陆首家通过 PromethION/GridION 双平台 DNA/RNA 全种类样本的公司。

对于ONT全长转录组测序的具体应用感兴趣的，敬请关注ONT全长转录组测序系列后续介绍。

参考文献

1.Payne A, Holmes N, Rakyan V, et al. Whale watching with BulkVis: A graphical viewer for Oxford Nanopore bulk fast5 files[J]. BioRxiv, 2018: 312256.