Nat Neurosci：单核RNA-seq&空间转录组在神经科学研究新进展

文章题目：Transcriptome-scale spatial gene expression in the human dorsolateral prefrontal cortex

发表期刊：Nature Neuroscience

影响因子：20.071

发表时间：2021年2月

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41593-020-00787-0.pdf

研究背景

大脑的空间组织与其功能有着根本的联系。这种结构-功能关系在人类大脑皮层的层状组织中尤其明显，在这种组织中，位于不同皮层的细胞表现出不同的基因表达模式，并表现出不同的形态、生理学和连接性模式。

单细胞（scRNA-seq）测序技术的重大进展极大地增加了对人脑中分子定义的细胞类型的鉴定，并将独特的细胞类别与特定脑疾病的风险联系起来。 

研究方法

选取神经系统的组织，进行空间转录组测序，构建空间表达谱，通过差异表达分析等揭示组织结构的表达差异。在此基础上，可以尝试结合单细胞转录组测序，或者已知功能基因的关联，深入揭示组织结构与功能的潜在关联。

研究结果

文章分析了来自三个成人组织切片中的空间基因表达。每对由两张相邻的10μm连续组织切片组成，第二对位于第一对的后方300μm处，结果总共有12个样本在Visium平台上运行（图1A，表S1）。将每个样本的平均深度定为291.1M（IQR:269.3M-327.7M），对应于平均3462个独特分子指数（UMIs）和平均1734个基因。

1、跨皮质层DLPFC的基因表达

将每个基因的UMI计数相加，以生成富含层的表达谱（图2A）。伪膨胀法将12个样本中的47681个点汇总为76层聚集图谱，消除了稀疏性，大大增加了基因的UMI覆盖率（图2A）。这些富含层的表达谱聚类揭示了与层间差异相关的顶部变异成分，特别是白质和灰质之间的差异（图2B）。组织学切片证实，1层（L1）细胞密度较稀疏，这是一个富含突触过程的分子层。这些分析证明了同时获取组织学和基因表达数据的能力，并强调了Visium平台在人类DLPFC中实现高分辨率空间表达谱的能力。使用了三种策略来执行差异表达（图CDE）分析。

2、人类皮层中新的层富集基因的鉴定

虽然已经确定了两个不同的标记基因，但这些研究使用了不同的技术，检测了不同的发育阶段。所以系统地评估了这些先前在成人DLPFC层富集基因表达数据集中鉴定的标记基因的稳定性。由于这些标记基因以前被注释到多个层面（即CCK和ENC1，图3），而不是分析中查询到的单个层面，所以使用分层表达谱来拟合每个基因的“最优”统计模型。例如，CCK被注释为L2、L3、L5和L6，在这个优化模型中结合L1、L4和WM一起被测试。虽然许多基因（FABP7，ADCYAP1，PVALB）在数据中显示了富含层的表达，但研究所并没有将它们归类为层标记，这证明了定量转录组尺度空间方法的实用性。事实上，在人类DLPFC中发现了几个以前被低估的层流标记基因，包括AQP4（L1）、HPCAL1（L2）、FREM3（L3）、TRABD2A（L5）和KRT17（L6）（图4）。使用多重单分子荧光原位杂交（图4）验证了这些新的层富集DEG。

3、单核RNA序列的空间配准

将空间分辨率添加到人脑组织产生的snRNA序列数据集，有可能进一步了解分子定义细胞的功能类型。具体来说, 从Visium数据中的“富集模型”得到的富含层的表达谱和差异表达统计数据可用于在空间上“注册”snRNA序列数据集，并将富含层的信息添加到不包含固有解剖信息的数据驱动表达簇中（图5 A）。 

 4、层富集基因表达谱的临床意义

鉴于一些研究已经确定了不同脑疾病和分子定义的细胞类型之间的关联，使用几个不同的脑疾病相关基因集评估了空间基因表达的临床相关性。通过DNA配基与不同疾病相关的基因组层富集程度，评估了具有多种大脑疾病和神经典型对照的患者死后大脑中差异表达的基因，以及转录组广泛关联研究（TWAS）与遗传风险相关的基因。进一步评估了与SCZD、ASD、双相情感障碍（BPD）和重度抑郁症（MDD）相关的常见基因变异近端基因的层流富集。这些分析确定了L2富集基因和L5富集基因与SCZD风险之间的显著重叠（Bonferroni<0.05），以及L2富集基因与双相情感障碍风险之间的额外重叠（FDR<0.05）。如上所述，ASD患者与SCZD疾病相关基因的层流富集程度明显不同。对两个大型SCZD死后大脑数据集中确定的DEG进行分析，虽然研究高度趋同，但显示在所有层面都有广泛的富集，与对照组相比，患者的L1、L2和L3基因表达增加，WM、L4、L5和L6基因表达减少（图6b）。这些分析强调了这些数据在收集临床见解方面的潜在效用，将成人DLPFC的富含层的基因表达纳入风险基因的解释中。

5、DLPFC中的数据驱动层聚类

最后，探讨了使用三种替代的“数据驱动”方法将可见斑点分为层流和非层流模式，与基于细胞结构手动注释层来识别富含层DEG的“监督”方法（图7A，B）形成对比，这在其他脑区或人体组织中缺乏清晰或确定的形态界限。虽然非层流信息用于识别SVG和HVG，但有趣的是这些基因集可以识别层流和非层流空间模式（图7c，D）。例如几种非层流的SVG，包括HBB、IGKC和NPY，它们可能与血细胞、免疫细胞和抑制性中间神经元类有关（图7D）。

结论

该研究使用10x Genomics Visium平台研究了人类背外侧前额叶皮层（DLPFC）中基因表达的空间结构。研究确定了广泛的层富集的表达特征，并细化了与以前鉴定的层状标记的关联。将层表达特征叠加到大规模的单核RNA测序数据上，增强了表达驱动簇的空间注释。通过整合神经精神障碍基因集，显示了精神分裂症和自闭症谱系障碍相关基因的差异层富集表达，突出了空间基因表达的临床意义。

文：阿强
排版：市场部

文献下载：

https://international.biocloud.net/zh/article/detail/33558695

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