文献速递：空间转录组+单细胞转录组揭示发育中小鼠胚胎的大脑单细胞分辨率的空间分子结构

文章题目：Molecular architecture of the developing mouse brain

发表期刊：Nature

发表时间：2021.7.28

实验平台：10x Genomics&In-situ Sequencing

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41586-021-03775-x

摘要

哺乳动物的大脑是通过扩散形态原、细胞-细胞相互作用和内在遗传机制而产生的复杂的内在空间线索发育而来，这些因素可能产生一千多种不同的细胞类型。完全理解这一过程，需要对整个大脑发育的时空范围内的细胞状态进行系统的描述。单细胞RNA测序和空间转录组学具有揭示复杂组织的细胞异质性的能力，该能力在神经系统的研究中特别强大。以前的研究探索了特定大脑区域、整个成人大脑甚至整个胚胎的发育。本文绘制了小鼠胚胎大脑从原肠胚到出生的全面的单细胞转录组图谱。本文鉴定了近800种细胞状态，描述了大脑及其外膜功能成分的发育程序，包括早期神经上皮、区域特异性次级组织以及神经源性和胶质源性祖细胞。本文使用原位mRNA测序来绘制关键发育基因的空间表达模式。将原位数据与本文的转录组数据相结合，揭示了神经系统形成过程中神经祖细胞的精确空间构成。

实验结果

1.构建发育中的小鼠脑的转录组图谱

      本文使用基于液滴的单细胞RNA测序，对小鼠第7天和第18天之间的胚胎脑每天 取样进行分析；过滤掉低质量和双细胞的数据，共得到93个样本，215个胚胎的292,495个细胞，每个细胞平均的转录本（UMI）和基因分别为5766个和1934个。使用最新版本的Cytograph分析流程，本文鉴定了798个簇（图一）。

t-SNE结果主要按胎龄对细胞进行分群，分支显示主要的神经上皮谱系。一个包含神经管及其衍生物的大的连接群被断开的小岛状小胶质细胞、红细胞和血管细胞包围着，这些细胞不是来源于神经上皮。在E7期, 细胞进入原肠胚形成时产生的三个胚层。神经嵴形成于E8 ~ E10期，且在E10 ~ E16期分化。早期神经管在E8形成，成熟为增殖的放射状神经胶质，是所有神经细胞的前体。两大群神经元从神经管分支出来，其中一群由前脑兴奋性神经元组成，另一个群包含所有其他类型的神经元。 前脑兴奋性神经元的清晰分离与之前在成年小鼠大脑中的发现一致，表明这些细胞类型有很强的转录和功能特异性。大约在E14后，放射状胶质细胞逐渐丧失增殖能力，转变为成胶质细胞，最终生成星形胶质细胞、室管膜和少突胶质细胞前体(OPC)细胞。

图一   发育中的小鼠脑细胞图谱

2.鉴定了神经胚形成后影响大脑形态发生的次级组织者

在原肠胚形成过程中，神经板的前后轴是通过外部信号建立的。相比之下，神经胚形成后的大脑形态发生是由特定的神经前体(称为次级组织者)发出的内在信号协调的。本文通过它们的已知形态因子的表达在E9-E11放射状胶质细胞簇中确定了次级组织者，包括Shh，Wnt-， Bmp-， Fgf-， neuregulin-和R-spondin家族基因，如图二。次级组织者亚型差异表达大量转录因子、分泌配体和表面受体。本文建立了丰富的次级组织者库。它们分泌形态因子组合，推测以区域特异性的互作方式诱导局部产生不同的神经元。

图二  神经管次级组织者的分子多样性

3. 鉴定了非神经元的细胞类型

簇状树状图的一个明显分支包括胶质细胞和相关祖细胞，并显示两个主要细胞群:表达神经源性标记的细胞群（如Neurog2或Dlx2）和表达胶质标记的细胞群（Tnc或Egfr等）(图3b，c).本文将后者称为成胶质细胞，因为它们可能具有胶质细胞的功能。本文发现有超过7000个基因在这两个细胞群中差异表达；胶质母细胞优先表达星形胶质细胞和少突胶质细胞相关基因。神经源性向胶质源性转变发生在E12和E16之间。本文发现了一个起源于早期神经嵴和间充质的分支脑膜谱系。对这些细胞进行详细的分析发现，他们显示原始成纤维细胞的细胞状态，在E9表达Mkx、Alx1、Alx3和Tbx18，并在E15时分化为软脑膜 (Col15a1)和蛛网膜(Slc22a2)。本文还发现了硬脑膜(Ccn3，以前称为Nov)和血管周围类成纤维细胞(Tcf21)，但其与脑膜谱系的关系尚不清楚。

在E9.5前，组织内的巨噬细胞和小胶质细胞由胚外的卵黄囊发育而来且侵入脑。本文观察到增殖的巨噬细胞早在E8期出现，一直持续到E14；并逐渐被小胶质细胞和血管周围巨噬细胞所取代。这些早期巨噬细胞表达不同的标记物，如Ybx3和Plac8，以及小胶质细胞(Tmem119)和边界巨噬细胞(Lyve1)标记物，这表明重叠的祖细胞状态分解成两种相反的命运。Spp1的高表达表明可能存在轴突束相关的小胶质细胞。

  图三  非神经元的细胞类型

4. 原位杂交测序鉴定神经系统形成过程中神经祖细胞的精确空间构成

发育中的大脑由表达特征性转录因子的不同空间域组成。随着时间的推移，这些域被涉及扩散形态形成物和细胞-细胞接触的区域相互作用所细化。为了将这个复杂的过程与转录细胞状态联系起来，本文在E10.5小鼠胚胎的24个矢状切片上对119个基因进行了原位杂交测序。使用Allen开发的小鼠大脑参考图谱手动注释解剖区域，以已知的基因表达模式和解剖标志为指导。本文使用了Tangram的一个广义版本将本文的单细胞簇与空间图像对齐，生成每个细胞状态的概率空间轮廓。Tangram模型使本文能够推测出没有直接进行原位测序的基因的空间表达模式，通常具有显著的准确性。例如，Prdm12和Six1正确定位于颅、背根神经节和脊索；本文使用空间分布进一步细化细胞聚类注释。

本文通过单细胞RNA测序(图2)确定的地板、屋顶和边界组织者在空间上分离并表达了不同的分泌配体和受体。本文的观察表明，即使是来源于相邻空间域的祖细胞，也会受到几个不同的环境因素的影响。虽然本文选择了原位测序的基因来分析次级组织者，但本文能够绘制出许多非神经细胞簇以及超过15个与颅神经节和感觉器官发育相关的细胞簇。例如，本文在视杯、晶状体、耳囊和鼻窝处绘制了簇状图。本文甚至可以检测到簇内剩余的空间多样性，包括背侧和腹侧的视杯和视柄细胞之间的过渡。早期巨噬细胞的一个亚群映射到发育眼睛的中心，可能反映了透明细胞，玻璃体中的常驻巨噬细胞。这个观察结果显示透明细胞起源于胚胎外卵黄囊(类似于小胶质细胞)，而不是起源于骨髓，而骨髓在此时还没有发育。

图四 发育脑细胞类型和细胞状态的空间分布

5. 原位杂交测序和转录组测序阐述神经元多样性的起源

大脑发育的一个核心问题是神经元多样性的起源。本文观察到，放射状胶质细胞在空间和转录上都具有多样性(图2,4)，并分泌比以前认识到的更多的可扩散的形态形成物，为特定的神经元细胞类型提供精确的局部线索。与此同时，本文只观察到87种放射状神经胶质细胞亚型，171种成神经细胞亚型和306种神经元亚型。从放射状神经胶质转变成神经细胞主要体现在几种突变：细胞循环退出,剪切活动突然增加和该转变所特有的转录因子模块的表达，这些转录因子在大多数谱系中保守。总的来说，这些观察支持神经前体细胞广泛由次级组织者形成的模式，但大多数神经元多样性是在神经母细胞和成熟神经元有丝分裂后产生的。

结语

转录组图谱概述了产前大脑转录组多样性，迈出了研究哺乳动物神经系统发育的重要一步。时间、谱系和区域特异性基因表达的丰富信息为基因靶向和理解神经发育障碍和脑癌提供了强有力的工具。

文：WLL

排版：市场部

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