文献分享 | Adv. Mater. | 结合饥饿/化学动力学治疗的原位喷雾凝胶用于IDH1胶质瘤术后治疗

今天分享一篇2021年11月份发表在Adv. Mater. 上的文章。该文的第一通讯作者是深圳大学的黄鹏教授。他的主要研究领域是（1）智能诊疗一体化；（2）分子影像；（3）纳米医学。该文的第二通讯作者是温州医科大学附属第一医院皮肤科的李智铭副主任。他的主要研究领域是皮肤病、自身免疫性皮肤病诊治。第一作者是Chunying Li。

胶质瘤（gliomas）是颅内最常见的恶性肿瘤，根据WHO的分类，其恶性程度最高的也称为胶质母细胞瘤。因其复发率高、病死率高、难治愈的特点，对人类健康造成了极大的威胁。约12 %的胶质母细胞瘤会发生异柠檬酸脱氢酶1（IDH1）基因突变，其中R132H突变占IDH1基因突变的92.7 %。

IDH1是三羧酸循环中的一种酶，可以将异柠檬酸转化为α-酮戊二酸（α-KG）。它有三种亚型，IDH1主要分布于细胞质，IDH2和IDH3主要分布于线粒体中。在生成α-KG的过程中还会生成NADPH和CO₂。NADPH在细胞中具有重要的生理作用，可参与形成活性的过氧化氢酶，合成脂质的脂肪酸，还作为一种辅酶，参与还原性谷胱甘肽（GSH）的生成。GSH向氧化性谷胱甘肽转化（GSSG）的过程中会通过消耗细胞内的活性氧（ROS）来维持细胞内的氧化平衡。然而，当IDHI发生突变，突变后产生的酶会将α-KG进一步转化成D-2-羟基戊二酸（D-2-HG）。D-2-HG会与氧化磷酸化过程中的ATP合酶结合并抑制ATP的生成。细胞内产生ATP的主要方式就是氧化磷酸化。氧化磷酸化过程被抑制，细胞只能通过糖酵解的方式获取ATP，而想要维持细胞正常的生命活动，就需要大量的葡萄糖来通过糖酵解产生足够的ATP。除此之外，在α-KG向D-2-HG转化过程中，需要消耗NADPH。NADPH的减少进一步会影响GSH的生成，使得细胞中的ROS不能被及时清除。因此，发生了IDH1突变的细胞，对葡萄糖的依赖性升高，以及对ROS敏感。

目前，手术被认为是治疗IDH1突变型胶质瘤最有效的治疗方法。然而，胶质瘤由于边缘模糊，往往难以切除，因此手术切除后肿瘤复发的情况很常见。

图 1  （a）GOx@MnCaP@fibrin的合成路线。（b）GOx@MnCaP@fibrin的使用方法。（c）GOx@MnCaP@fibrin进入细胞后饥饿疗法与化学动力学疗法的作用机制。

基于上述问题，作者开发了一种饥饿疗法与化学动力学治疗协同作用的原位喷雾凝胶，用于杀死手术后剩余的胶质瘤细胞，避免复发。如图1a所示，葡萄糖酶与掺锰磷酸钙通过生物矿化的方式形成了GOx@MnCaP。为了延长其在体内的存留时间，作者还使用了纤维蛋白凝胶。这是美国食品药品监督管理局批准的药用辅料。它是由纤维蛋白原和凝血酶两部分相互作用形成的。将GOx@MnCaP与纤维蛋白原溶液混合，然后与凝血酶以体积比1:1一起喷于切除胶质瘤的伤口处。纤维蛋白原被凝血酶酶解为纤维蛋白单体，并交联形成稳定的纤维蛋白凝胶，起到药物缓释、术前和术后止血以及组织黏合的作用（图1b）。当GOx@MnCaP进入细胞时，首先在酸性环境下分解释放出葡萄糖酶GOx和Mn²⁺。葡萄糖酶将葡萄糖氧化成葡萄糖酸和H₂O₂，这属于饥饿疗法。H₂O₂在Mn²⁺的作用下，通过类芬顿反应生成对细胞具有高毒性的·OH，这属于化学动力学疗法。并且饥饿疗法生成的葡萄糖酸会加速GOx@MnCaP的分解，释放出更多的Mn²⁺，生成更多的H₂O₂来杀死细胞。两种疗法协同作用，杀死手术后残留的胶质瘤细胞，如图1c所示。

图 2  （a）Western blot分析IDH1（R132H）蛋白在IDH1（R132H）突变型U87细胞上的表达。（b）共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）成像显示IDH1（R132H）的表达。（c）IDH1（R132H）细胞中NADPH的水平。（d）IDH1（R132H）细胞中GSH的水平。（e）不同葡萄糖浓度下经GOx@MnCaP处理后H₂O₂的产生情况。（f）GOx@MnCaP@fibrin的低温扫描电子显微镜图像。（g）体外不同pH值下GOx@MnCaP@fibrin释放Mn²⁺的情况。（h）在切除腔内注射用IR-800标记的GOx@MnCaP和GOx@MnCaP@fibrin后，U87荷瘤小鼠的体内荧光成像。

作者首先利用慢病毒法成功构建了IDH1突变型U87细胞，并通过Western bot实验进行验证（图2a）。为了更直观的观察，作者又用荧光染料Alexa Flour@647对IDH1（R132H）进行了标记，还用Hoechst对细胞核进行标记（图2b）。发现IDH1（R132H）主要在细胞质中大量表达。作者又通过检测细胞中NADPH和GSH的水平来进一步验证细胞中IDH1（R132H）的成功构建（图2c，d）。随后，作者探究了GOx@MnCaP在不同的葡萄糖浓度下生成H₂O₂的浓度和速度（图2e）。随着葡萄糖浓度的升高，H₂O₂的浓度和速度是显著升高的。作者还利用低温扫描电镜观察了GOx@MnCaP@fibrin的形貌（图2f）。由于GOx@MnCaP@fibrin在体内的释放是依赖于微环境的弱酸性，因此作者在体外探究了GOx@MnCaP@fibrin对pH的响应情况（图2g）。比起pH=7.4时，pH为6.5时，释放的Mn²⁺的浓度是显著升高的，说明GOx@MnCaP@fibrin在微酸性环境中具有良好的释放性能。最后，作者为了研究GOx@MnCaP和GOx@MnCaP@fibrin在伤口处的留存情况，采用IR-800标记，通过荧光强度的变化来体现浓度的变化（图2h）。

图 3  （a）IDH1（WT）和IDH1（R132H）细胞共孵育后ATP水平的降低。（b）IDH1（WT）细胞和IDH1（R132H）细胞与GOx@MnCaP在不同浓度的葡萄糖共孵育后的细胞活力。（c）用GOx@MnCaP孵育12小时后，用CA/PI染色的IDH1（WT）细胞和IDH1（R132H）细胞的荧光成像。（d）与GOx@MnCaP共孵育24小时后，用ROS荧光探针染色的IDH1（WT）细胞和IDH1（R132H）细胞的荧光图像。（e）图d的数据输出图。

作者首先在体外探究了GOx@MnCaP饥饿疗法与化学动力学治疗协同作用的效果。如图3a所示，随着GOx@MnCaP的浓度升高，分解出的GOx浓度增加，对细胞内的葡萄糖分解作用增强，进而影响细胞中ATP的合成。并且从图中还可以看出，发生了IDH1（R132H）突变的细胞比野生型细胞受到的影响更大。随后作者又探究了葡萄糖浓度对细胞活性的影响。如图3b所示，对细胞进行相同的GOx@MnCaP处理，葡萄糖浓度越高，细胞活性越低，且突变型细胞的细胞活性比野生型细胞的细胞活性更低。为了使结果更直观一点，作者用钙黄绿素乙酰氧甲基酯CA和碘化吡啶PI对细胞进行染色（图3c）。可以看出经过GOx@MnCaP处理的细胞，红色荧光显著增强，绿色荧光显著减少，且发生了IDH1（R132H）突变的细胞几乎没有绿色荧光，说明几乎完全杀死了细胞。最后，作者利用活性氧探针对GOx@MnCaP处理过程中细胞产生的ROS的情况进行了探究，如图3d所示。在GOx@MnCaP处理过程中，发生了IDH1（R132H）突变的细胞其ROS的生成量是最多的。图3e是图3d的数据输出图。

图 4  （a）经GOx@MnCaP处理的IDH1（WT）和IDH1（R132H）细胞的显微镜图像。（b）经不同浓度GOx@MnCaP处理的IDH1（WT）和IDH1（R132H）细胞迁移的位移变化。（c）经不同浓度GOx@MnCaP处理的IDH1（WT）和IDH1（R132H）细胞迁移的速度变化。（d）经GOx@MnCaP处理的IDH1（WT）和IDH1（R132H）细胞迁移的情况。（e）经GOx@MnCaP处理的IDH1（WT）和IDH1（R132H）细胞的显微镜图像。（f）经GOx@MnCaP处理的IDH1（WT）细胞数量的定量分析。（g）经GOx@MnCaP处理的IDH1（R132H）细胞数量的定量分析。（h）经GOx@MnCaP处理的IDH1（WT）细胞和IDH1（R132H）细胞的增值率。

在肿瘤复发过程中，细胞的迁移的增殖是影响肿瘤复发的两大因素，因此作者又探究了GOx@MnCaP对细胞迁移和增殖的影响。作者首先利用显微镜研究了经GOx@MnCaP处理后突变型细胞和野生型细胞的迁移路径图像，可以看出两种细胞的迁移都不明显，且细胞形态有所改变（图4a）。随后作者又对细胞迁移的距离和时间进行了研究，发现随着GOx@MnCaP浓度的升高，细胞迁移的距离和速度是下降的，且突变型比野生型细胞下降的更为明显，如图4b、c所示。图4d散点图也说明GOx@MnCaP处理后的细胞其迁移受到了明显的抑制。同样的，作者对GOx@MnCaP影响细胞增殖的情况也进行了研究。图4e是利用显微镜研究了处理后的细胞的增殖情况，可以看出细胞数量并没有显著变化，且经处理后的突变型细胞其细胞形态发生了明显变化。作者又对两种细胞经不同处理后不同时间的细胞数量进行了研究，发现经GOx@MnCaP处理的两种细胞在12 h后细胞数量没有较大的改变（图4f、g）。图4h分别是他们的细胞增殖率，可以看出经GOx@MnCaP处理后的细胞其增值率有明显的抑制效果，且突变型细胞的抑制效果好于野生型。

图 5  （a）与GOx@MnCaP共孵育4 h后基因表达的变化情况。（b）经GOx@MnCaP处理4 h后的IDH1（R132H）细胞中与凋亡、增殖和迁移相关的差异调控基因的火山图谱。（c）经GOx@MnCaP处理后的IDH1（R132H）细胞中出现显著上调或下调的通路的KEGG富集分析图。（e）经GOx@MnCaP处理后的IDH1（R132H）细胞中上调了的生物学过程的GO注释分析图。

P53通路在细胞中的主要作用是阻止细胞周期和促进细胞凋亡。除了葡萄糖供给不足，在高的ROS水平以及氧化应激可能带来的DNA损伤的情况下，p53通路可能被激活。因此，作者猜测GOx@MnCaP处理细胞可能导致了细胞中p53通路的激活。为了近一步探究GOx@MnCaP是如何影响细胞增殖的迁移的，作者又进行了转录组学分析。首先，作者分析了经GOx@MnCaP处理后的IDH1（R132H）细胞中表达量变化最明显的39个基因，发现它们都与细胞凋亡、增殖、迁移有关（图5a）。随后作者又对相关基因进行了分析，发现p53通路中与细胞凋亡有关的蛋白都是高表达（图5b）。因此作者推测GOx@MnCaP可能通过激活p53通路来诱导细胞凋亡。随后，作者又通过KEGG富集分析了经处理的细胞中显著上调或下调的通路，发现p53通路确实得到了上调（图5c）。最后作者还通过GO注释分析了在IDH1（R132H）细胞中上调的生物学过程，发现大都是与细胞凋亡有关（图5d）。

图 6  （a）术后皮下IDH1（R132H）萤火虫荧光素酶-U87荷瘤小鼠的荧光图像。（b）两种类型肿瘤经不同治疗后的肿瘤生长曲线。（c）接受不同治疗后小鼠的肿瘤体积变化。（d）接受不同治疗后小鼠的生存率变化。（e）接受不同治疗期间各组小鼠的体重变化。

最后，作者探究了在生物体内GOx@MnCaP@fibrin抑制肿瘤复发的能力。为了实时监测肿瘤复发情况，作者设计将萤火虫荧光素酶在U87细胞中稳定表达。作者首先构建了小鼠胶质瘤切除术后模型，然后对伤口处进行了不同处理（图6a）。图6b是小鼠肿瘤体积随时间的变化情况。从图中可以看出，在突变型胶质瘤模型中，未处理的小鼠和仅用凝胶处理的细胞均出现了复发的情况，而用GOx@MnCaP@fibrin处理的细胞8只里面仅有三只出现了复发的情况。而在野生型胶质瘤小鼠模型中，用凝胶处理的小鼠全部出现了复发情况，而GOx@MnCaP@fibrin处理的小鼠5只里有3只出现了复发情况。图6c是各组肿瘤体积的汇总图。随后作者又探究了小鼠的生存率，发现经GOx@MnCaP@fibrin处理的突变型胶质瘤小鼠的生存率最高，其次是经GOx@MnCaP@fibrin处理的野生型胶质瘤小鼠，说明GOx@MnCaP@fibrin可以抑制胶质瘤复发，延长小鼠生存期，且对IDH1（R132H）突变型胶质瘤的抑制作用更好（图6d）。最后，作者还探究了治疗期间小鼠的体重变化，可以看出各组小鼠的体重均没有较大变化，说明GOx@MnCaP@fibrin对身体没有其他副作用（图6e）。

综上所述，作者开发了一种饥饿疗法与化学动力学疗法相结合的方式，用于解决胶质瘤手术复发风险高的问题。GOx@MnCaP中的GOx将葡萄糖转化为葡萄糖酸和H₂O₂，降低细胞内葡萄糖浓度减少ATP生成，且生成的H₂O₂在Mn²⁺的催化下通过类芬顿反应生成细胞毒性更高的·OH，两种途径协同作用，杀死IDH1（R132H）胶质瘤细胞，从而达到抑制胶质瘤复发，提高生存率的目的。且这种方法制备简便，喷雾的形式使用也很方便，在今后的临床应用中具有很大的发展前景。

作者：蘧文雅

核稿者：张馨、刘丽

上传者：刘继红

原文链接:

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/adma.202103980

原文引用：

https://doi.org/10.1002/adma.202103980