Nature | GSDMB蛋白通道活性的调控机制：揭开背后的奥秘

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焦亡作为细胞应对感染和内源性威胁的一种重要的免疫防御手段¹，主要由gasdermin家族成员介导。该家族成员均由N端孔道形成结构域和C端自抑制结构域组成²，其中，gasdermin B (GSDMB) 作为这个家族种最具代表性的成员之一，能够通过被caspase水解释放N端孔道形成结构域，破坏细胞膜，从而引发细胞溶解³，其多态性与哮喘等疾病的发生存在密切的相关性⁴。

通常情况下，GSDMB被自然杀伤 (natural killer, NK) 细胞或细胞毒性T淋巴细胞释放的颗粒酶A （granzyme A, GZMA） 激活， N端结构域和C端结构域之间的K244被切割⁵，进而导致N端孔道形成结构域被释放。细胞毒性T细胞通过这样的方式诱导癌细胞发生焦亡是机体抗肿瘤免疫的一个重要组成部分⁶。

近期发表的一项研究发现，导致痢疾发生的病原体Shigella flexneri (福氏志贺菌) 能够通过其III型分泌系统的效应因子IpaH7.8特异性的泛素化GSDMB，使其发生蛋白酶体降解 (图1)。同时，研究者发现，GSDMB在被GZMA激活后并未导致细胞焦亡的发生，而是杀死了在细胞内定殖的细菌⁷。与此相关的另外一项研究则发现，在炎性肠病中，GSDMB在小肠上皮细胞的维持和修复中发挥作用，且并未导致细胞焦亡的发生。这些研究结果促使研究人员对GSDMB的孔道形成特性以及其在焦亡中发生的具体作用进行更加深入的探究。

图1. 福氏志贺郡IpaH7.8通过导致GSDMB泛素化降解抑制焦亡发生 (图源X-mol.com)

2023年3月29日，来自中科院生物物理所的丁璟珒团队和来自北京生命科学研究所的邵峰团队共同在Nature上在线发表了题为Structural mechanisms for regulation of GSDMB pore-forming activity的科研论文。研究者通过结合X射线晶体学、冷冻电镜和功能分析等手段，解析了GSDMB的高分辨率晶体结构和GSDMB孔道的冷冻电镜结构，为研究GSDMB在多种疾病中的作用提供了新的见解，同时也为开发与GSDMB相关疾病的治疗策略提供了潜在的治疗靶点。

研究发现，IpaH7.8蛋白可以有效降解人体内的GSDMB和GSDMD蛋白，但IpaH7.8的C357S突变则无相应活性。对不同的IpaH家族成员而言，它们的LRR (leucine-rich repeat) 结构域各异，但C端泛素连接酶结构域几乎完全相同。在分子筛上，IpaH7.8蛋白的LRR结构域 (IpaH7.8^LRR) 可以和GSDMB以1：1的化学计量比特异性地结合，表面等离子共振揭示二者之间的结合常数 (K_d) 为432 nM。

在本文解析得到的IpaH7.8^LRR–GSDMB复合物的晶体结构中，IpaH7.8的LRR结构域与GSDMB的N端结构域结合 (图2,b)。IpaH7.8的LRR4-LRR9区域与GSDMB N端的β3以及附近的结构紧密相互作用，形成氢键网络，稳定IpaH7.8与GSDMB的结合。IpaH7.8与GSDMB的结合受到特定的界面残基的控制，例如R125、E145和Y165-Y166等残基与GSDMB的E95、I97和R99等残基形成氢键网络，E205、Y207和R228等残基与GSDMB的R124、R208和D17/D21等残基发生相互作用 (图2,c)，提示IpaH7.8通过LRR结构域与GSDMB的N端结构域特异地结合，形成特定的互作界面，从而实现对GSDMB的降解。通过对界面残基的突变，研究者进一步对这些氨基酸残基的功能进行了验证。

图2. IpaH7.8^LRR-GSDMB复合物晶体结构

GSDMB C端结构域的中央是一个由M245，M252，A331，Y378，A387和V390构成的疏水口袋，N端结构域和C端结构域主要通过GSDMB-N中的α1和相邻的β1/β2相接触，此外，α6的F178和I182位于GSDMB C端结构域αF–αH之间一个非极性的浅坑中 (图3)。GSDMB两个结构域在这两处的相互作用，尤其是亲水性相互作用，相比于GSDMD和GSDMA更加广泛。后续的生化实验也证实了这些互作的特性确实与GSDMB更强的自抑制能力相关。

图3. GSDMB N端结构域与C端结构域之间的关系

GSDMB有十种剪接变异体，能产生五种亚型（GSDMB^iso1至GSDMB^iso5）。GSDMB^iso1至GSDMB^iso4之间的差异在于外显子6和外显子7的选择性剪接导致GSDMB N端结构域的C端以及结构域间连接区存在序列差异。GSDMB^iso3包含了这两个外显子的所有序列，而GSDMB^iso2则没有，GSDMB^iso4和GSDMB^iso1分别只有外显子6或外显子7的序列 (图4,a)。通过对IpaH7.8LRR – GSDMB^iso4复合物的结构分析，发现介导IpaH7.8识别的结构元件在所有四种亚型中都存。GZMA的剪切位点存在于GSDMB^iso1到GSDMB^iso4中，因此研究者推测在各个亚型中，IpaH7.8都将抵消GZMA诱导的细胞焦亡。在GZMA刺激的293T细胞中表达野生型IpaH7.8和任何GSDMB亚型均未观察到焦亡现象的出现。然而当野生型IpaH7.8被IpaH7.8C^357S替换时，GZMA仍不能诱导表达GSDMB^iso1和GSDMB^iso2的细胞出现焦亡，提示不同的GSDMB亚型在细胞焦亡中可能发挥不同的作用。通过脂质体泄漏实验，结合负染电子显微镜观察，研究者进一步证实了GSDMB亚型依赖性的孔道形成活性 (图4,g)。

图4. GSDMB不同可变剪接之间的序列以及孔道形成能力的差异

在利用LMNG溶解GSDMB^iso4形成的孔道并对蛋白样品进行纯化后，研究者对样品进行了冷冻电镜数据采集和结构解析，二维分类结果显示GSDMB孔有26次至30次的对称性，多数孔道由26、27或28个蛋白质亚单位组成，其中27次对称的孔道复合物最终整体结构域达3.2 Å。GSDMB孔道的内径和外径分别约为160 Å和270 Å，孔道含有一个冠状环和一个跨膜β-桶环结构，通过GSDMB N端结构域的球形亚结构域以及并排延伸的β-发夹结构相连 (图5,a)。

在孔道形成状态与自抑制状态下，GSDMB N端结构域会发生构象变化。在孔道形成状态下，GSDMB N端结构域中连接α3和β3的长而松散的环会变得有序，新的、延伸的β3得以形成，此外，包含短β4的linker转换为β转角和折叠，与原始β5融合成一个延伸的β4。新的β3和β4共同形成一个大的、反向平行的β-发夹结构，β3/β4和β6/β7形成的发夹结构并排排列，插入膜结构之中 (图5,d)。

图5. 冷冻电镜解析完整的GSDMB孔道结构

在孔道形成状态下，GSDMB球型亚结构域底面的β1 / β2发夹的转角处暴露在外，在GSDMD中，该发夹结构具有两个可能作为膜锚定位点的芳香族氨基酸，GSDMB中对应的氨基酸（F46和F47）很可能具有相同的作用。F46和F47周围两个带正电荷的氨基酸残基则形成了可以与酸性磷脂极性头部相互作用的位点 (图5,e)。结合后续的生化实验，研究者对以上的分析进行了进一步验证。

在GSDMB孔道中，每个原体的β7都通过广泛的氢键与相邻原体的β3相互作用，通过这种方式，所有原体的四股β-hairpin共同组成跨膜的β桶结。此外，每个原体球形结构域上的凸面都会嵌入相邻原体的凹面口袋中，组装形成孔道的冠状环 (图6)。

图6. GSDMB孔道中相邻分子之间的关系

GSDMB^iso3和GSDMB^iso4中存外显子6中的序列，而GSDMB^iso1和GSDMB^iso2中则不存在，这些序列对GSDMB的孔道形成活性至关重要。在自抑制的GSDMB^iso4结构中，来源于外显子6的13个氨基酸残基 (N221-E233) 形成β10和GSDMB N端结构域域有序的尾部，虽然该区域在孔道形成状态中结构相同，但在孔道组装中过程中却发挥着多种关键作用 (图7,e)。I222或F231突变会破坏GSDMB的孔道形成能力，并抑制细胞焦亡的发生。通过进一步解析GSDMB^iso1与IpaH7.8^LRR复合物的晶体结构，研究者发现GSDMB^iso1和GSDMB^iso2不能诱导细胞焦亡的原因不仅在于外显子6来源序列的缺失，还与结构上存在的其他差异相关，如，GSDMB^iso1的N端结构域的C端与GSDMB^iso4不同 (图7,f)。

图7. GSDMB^iso1和GSDMB^iso4诱导焦亡能力差异的结构基础

综上，本文揭示了IpaH7.8靶向GSDM的分子机制，同时发现GSDMB可变剪接所形成的不同亚型决定了其孔道形成能力和促细胞焦亡发生的能力，不同亚型之间的差异或许可以对未来癌症免疫疗法的开发提供一定的指导作用。

原文链接

https://www.nature.com/articles/s41586

-023-05872-5

参考文献

参考文献

1.Jorgensen, I. & Miao, E. A. Pyroptotic cell death defends against intracellular pathogens. Immunol. Rev. 265, 130–142 (2015).

2.Broz, P., Pelegrin, P. & Shao, F. The gasdermins, a protein family executing cell death and inflammation. Nat. Rev. Immunol. 20, 143–157 (2020).

3.Ding, J. et al. Pore-forming activity and structural autoinhibition of the gasdermin family. Nature 535, 111–116 (2016)

4.Das, S. et al. GSDMB induces an asthma phenotype characterized by increased airway responsiveness and remodeling without lung inflammation. Proc. Natl Acad. Sci. USA 113, 13132–13137 (2016).

5.Zhou, Z. et al. Granzyme A from cytotoxic lymphocytes cleaves GSDMB to trigger pyroptosis in target cells. Science 368, eaaz7548 (2020).

6.Wang, K. et al. Structural mechanism for GSDMD targeting by autoprocessed caspases in pyroptosis. Cell 180, 941–955 (2020).

7.Hansen, J. M. et al. Pathogenic ubiquitination of GSDMB inhibits NK cell bactericidal functions. Cell 184, 3178–3191 (2021).

8.Rana, N. et al. GSDMB is increased in IBD and regulates epithelial restitution/repair independent of pyroptosis. Cell 185, 283–298 (2022).

供稿 | 王彤彤

审稿 | 丛野

责编 | 囡囡

排版 | 可洲

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THE END

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