Nature | 伸向肝脏的“恶魔之手”——肿瘤EVPs诱导肝脏代谢功能障碍

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癌症是由胞外囊泡和颗粒（extracellular vesicles and particles, EVPs）在内的可溶因子释放所介导的系统性疾病，会改变转移靶器官以外的多个器官的功能^1,2。肿瘤EVPs可以在多种未转移器官中建立转移前生态位（pre-metastatic niches, PMNs）并重编程细胞功能³。肝脏被认为是肿瘤EVPs首要靶向的器官之一^4-6，然而肝脏在未转移的癌症进展过程中所发生的功能重编程还未有广泛研究，这使得研究者们想要探究EVPs在改变肝脏功能中的作用。

2023年5月24日，美国威尔康奈尔医学院的David Lyden，Haiying Zhang和Robert E. Schwartz作为共同通讯作者，在Nature期刊发表了名为“Tumour extracellular vesicles and particles induce liver metabolic dysfunction” 的文章。该研究鉴定了肿瘤来源的EVPs是癌症诱导肝脏重编程的重要介质，其运载的脂肪酸，尤其是棕榈酸（palmitic acid），引起肝脏的巨噬细胞Kupffer细胞分泌肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF），产生促炎症微环境，抑制脂肪酸代谢和氧化磷酸化，促使形成脂肪肝。肿瘤植入或肿瘤EVPs预处理会以TNF依赖的方式减少细胞色素P450基因的表达并减缓药物代谢。此外，肿瘤EVP增强了化疗的副作用，包括骨髓抑制和心脏毒性，意味着肿瘤EVP对肝脏代谢的重编程可能会限制癌症患者的化疗耐受性。研究结果揭示了肿瘤来源的EVP如何失调肝脏功能及其靶向潜力，以及结合TNF抑制，如何防止脂肪肝形成并提高化疗疗效。

研究表明，炎症、脂肪肝和代谢紊乱是小鼠模型和肝外转移患者肝脏系统性受损的标志。为了研究癌症如何影响肝脏，研究者原位植入了小鼠B16F10黑色素瘤细胞或K7M2骨肉瘤细胞，这种细胞更倾向于向肺部转移。植入三到四周后，研究者们观察到没有模型出现肝脏转移，但通过组织学在K7M2模型中检测到了肺部转移。值得注意的是，对照组和荷瘤小鼠的无转移肝脏RNA测序结果显示（图1a），两个模型中469个上调的基因和317个下调的基因转录变化一致（q<0.05）。基因集富集分析（GSEA）显示免疫稳态和代谢失调，包括与NF-κB介导的炎症和TNF信号传导相关，以及减弱的氧化磷酸化和脂肪酸代谢（图1b）。

图1 远处原发性肿瘤引起肝脏代谢功能异常

其他原位低转移性黑色素瘤B16F1和非转移性（67NR）以及高转移性（嗜肺4T1）乳腺癌模型的无转移肝脏在免疫应答和代谢相关的通路中具有相似的变化，意味着多种癌症类型系统地且统一地重编程了肝脏功能。为了评估肝脏代谢功能障碍，该研究进行了代谢组质谱和偏最小二乘判别分析（PLS-DA），结果表明B16F10或K7M2荷瘤小鼠与对照组相比，其无转移肝脏的氨基酸、碳水化合物、辅因子和维他命、三羧酸循环、脂质和核酸的代谢物谱显著增高。由于脂质相关代谢通路受到了影响，研究者进行了脂质组学质谱分析。PLS-DA结果表明B16F10或K7M2荷瘤小鼠与对照组的肝脏脂质谱有所不同。多种脂类，包括磷脂、鞘脂和中性脂类，以及多种胆固醇酯和甘油三酯在荷瘤小鼠的肝脏中显著增加（图1c,d）。

非酒精性脂肪肝（NAFLD）与肝脏胆固醇、甘油三酯和神经酰胺的积累有关。研究者们通过BODIPY染色定量了不同肿瘤模型肝脏的脂滴形成量。他们发现荷瘤小鼠的肝脏比对照组有更多的脂滴积累（图1e,f），表明脂肪肝在多种癌症模型中普遍存在。

为了确定这些结果的临床相关性，研究者们分析了植入人SK-MEL-192黑色素瘤或七个患者来源的骨肉瘤异源移植小鼠的未转移肝，发现这些模型均具有脂肪肝。随后，研究者对新确诊局部胰腺导管腺癌（PDAC）的患者进行了肝活检RNA测序分析。如图1g所示，测序结果表明这些患者与对照组相比具有显著改变的免疫稳态（即NF-κB介导的TNF信号传导）和代谢功能（即脂肪酸代谢和氧化磷酸化），这与小鼠实验结果一致。尽管癌症患者和对照组的体重相似，但胰腺导管腺癌患者的活检和尸检均发现了肝外转移的脂肪肝疾病（图1h）。因此，未发生肝转移时，远处肿瘤也可以破坏癌症患者的肝脏代谢和引发脂肪肝形成。

由于肝脏被认为是肿瘤EVPs首要靶向的器官之一^4-6，研究们探究了是否是肿瘤分泌的因子，尤其是EVPs，靶向肝脏以引发代谢功能障碍和脂肪肝生成。他们通过离心从B16F10和K7M2肿瘤外植体分离了异质囊泡群（小外泌体Exo-S，60-80 nm；大外泌体Exo-L，90-120 nm）和微粒（exomeres，< 50 nm），并通过透射电镜和纳米颗粒追踪分析对其进行了表征。如图2a,b所示，将近红外染料标记的B16F10和K7M2肿瘤外植体EVPs（tumor explant-derived EVPs，TE-EVPs）静脉注射到小鼠24小时后，全器官成像证实了肝脏对EVPs的摄取。

为了研究TE-EVPs处理在肝脏代谢中的作用，研究者每隔一天向小鼠静脉注射与生理浓度相当的B16F10-TE-EVPs或K7M2-TE-EVPs，持续四周。随后对TE-EVPs或PBS对照处理的小鼠肝脏进行RNA测序和代谢组及脂质组质谱分析，结果如图2c-h所示。

图2 肿瘤衍生的EVPs引起肝脏代谢功能障碍

如图2c,d，转录组分析发现TE-EVPs处理的肝脏免疫应答增强且代谢减缓（即氧化磷酸化和脂肪酸代谢）。代谢组质谱则表明TE-EVPs处理和荷瘤小鼠的肝脏具有相似的代谢失调状况（图2e,f）。脂质（如磷酰乙醇胺、胆固醇和谷甾醇）和脂质代谢相关途径（如磷脂腺乙醇胺、磷脂酰胆碱和类固醇生物合成途径）在B16F10-TE-EVP处理的肝脏中丰度较高（图2e）。此外，TE-EVP处理的肝脏也有部分氨基酸和碳水化合物的富集（图2e,f）。脂质组质谱进一步揭示了神经酰胺和胆固醇酯在B16F10-TE-EVP处理肝脏中的上调，以及甘油三酯在B16F10-TE-EVP和K7M2-TE-EVP处理肝脏中的上调。与上述结果一致，TE-EVP处理肝脏相比于对照组表现出脂滴的累积，尽管其累积量相比于荷瘤小鼠的肝脏稍少（图2i,j）。此外，研究者还发现微粒、Exo-S和Exo-L均能引起炎症和肝脏功能变化，并引发脂肪肝生成，但微粒和Exo-S引起的脂肪肝形成程度比Exo-L更强（图2l）。这意味着微粒是引起脂肪肝的主要原因，这与前面发现肝脏对微粒的摄取的数据一致。

随后，该研究将荧光标记的细胞系衍生EVPs（cell line-derived EVPs，CL-EVPs）B16F10-CL-EVPs或K7M2-CL-EVPs注射到小鼠体内，并在注射24小时后对肝脏进行流式分析。结果显示两种模型的EVPs主要被CD45+免疫细胞和CD31+血管内皮细胞摄取。其中，摄取EVPs的CD45+免疫细胞90%以上为Cd11b+F4/80+  Kupffer细胞（图3a,b）。将小鼠Kupffer细胞耗竭并对肝脏切片做体外EVP处理发现，B16F10或K7M2模型的CL-EVPs和TE-EVPs均不能引起肝脏切片中的脂滴形成。这些数据表明，Kupffer细胞对于肿瘤EVP引起的脂肪肝形成非常重要。

图3 Kupffer细胞摄取肿瘤衍生的EVPs

后续实验发现，无论是荷瘤小鼠还是EVP处理小鼠，Kupffer细胞会大量分泌TNF，使其血浆内水平显著高于对照组（图4a,b）。若用重组TNF处理原代肝细胞，会引起脂滴的形成（图4c），转录组分析发现，TNF处理会使其脂质和脂肪酸分解代谢指标显著下降。若向荷瘤小鼠腹腔注射TNF阻断抗体，则会在不影响肿瘤生长的情况下，观察到肝脏脂滴的积累减少（图4d）。在EVP处理小鼠中使用TNF阻断抗体也可以得到相似的结果（图4e），意味着Kupffer细胞分泌的TNF对于肿瘤EVP引起的脂肪肝不可或缺。

图4 肿瘤EVP中的棕榈酸诱导Kupffer细胞分泌TNF并促进脂肪肝形成

对B16F10-TE-EVPs和对照组进行代谢组质谱分析发现，长链饱和脂肪酸，尤其是棕榈酸和硬脂酸，在B16F10-TE-EVPs中显著富集。棕榈酸处理可以诱导Kupffer细胞的Tnf表达，脂肪酸合成酶抑制剂C75的处理在使得游离脂肪酸含量下降的同时会影响EVP对Kupffer细胞Tnf的诱导表达（图4h）。此外，原代成骨细胞分泌的EVPs含有少量棕榈酸，尽管肝脏对其EVP具有有效摄取，其在体内或体外均不能诱导Kupffer细胞的Tnf表达或脂滴累积。

在晚期癌症患者中经常观察到标准化疗的低耐受性，这可能与肝脏解毒能力受损有关。该研究发现，重组TNF会下调小鼠肝细胞中与人源细胞色素P450同源物相关的核心基因Cyp（图5a）。这些基因在B16F10荷瘤小鼠或B16F10-CL-EVP处理小鼠分离得到的肝细胞中同样下调（图5b,c）。值得关注的是，CYP可以代谢70-80%的处方药，而在TNF处理的原代肝细胞、B16F10荷瘤小鼠肝脏和无肝转移的胰腺癌患者中均存在细胞色素P450信号通路下调的情况。

图5 肿瘤EVPs抑制肝脏药物代谢

综上所述，远处肿瘤的EVPs会引发无瘤肝脏的炎症和脂质分解代谢下调，重编程小鼠和癌症患者的新陈代谢（图6）。在机制层面，肿瘤EVPs中的棕榈酸会刺激Kupffer细胞分泌TNF，因此促进脂肪肝形成。阻断癌细胞的EVP分泌、耗竭Kupffer细胞或阻断TNF均能挽回这些表型。此外，该研究表明微粒作为主要靶向肝脏的EVP，是脂肪肝形成的“首要元凶”。EVP引起的脂肪肝可能会在其他部位为肿瘤的生长提供能量，与非酒精性脂肪肝能够增加肝外癌症风险的相关报道一致。

图6 EVP介导的肝脏代谢失调工作示意图

因此，癌症治疗需要考虑到其系统性影响。恢复肝功能的策略对减小副作用和增强对肝脏代谢的化疗药物的治疗反应至关重要。此外，还需考虑抑制肿瘤EVP产生的策略，以防止肝脏代谢功能障碍和转移前生态位的形成。最后，正常肝功能的恢复或许可以进一步预防癌症相关的系统性疾病。

原文链接

https://www.nature.com/articles/s41586-023

-06114-4

参考文献

参考文献

1.McAllister, S. S. & Weinberg, R. A. The tumour-induced systemic environment as a critical regulator of cancer progression and metastasis. Nat. Cell Biol. 16, 717-727 (2014).

2.Lucotti, S., Kenific, C. M., Zhang, H. & Lyden, D. Extracellular vesicles and particles impact the systemic landscape of cancer. EMBO J. 41, e109288 (2022).

3.Zhang, G. et al. Tumor induces muscle wasting in mice through releasing extracellular Hsp70 and Hsp90. Nat. Commun. 8, 589 (2017).

4.Zhang, H. et al. Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation. Nat. Cell Biol. 20, 332–343 (2018).

5.Hoshino, A. et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature 527, 329–335 (2015).

6.Zhang, H. et al. Exosome-delivered EGFR regulates liver microenvironment to promote gastric cancer liver metastasis. Nat. Commun. 8, 15016 (2017).

供稿 | 张颖

审稿 | 田露

责编 | 囡囡

排版 | 可洲

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THE END

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