Nature｜轴丝周期性重复结构——揭示纤毛摆动的机理及疾病相关性

Journal Club

 汇聚思想，点燃新识

Journal Club 凝聚了一批热爱科学、享受科学、传播科学的探索者和发现者。他们志同道合，他们青春飞扬，他们与科学共舞。在这里，你可以收获最新、最真的行业资讯和来自科研一线的文献解读。你关心的就是我们要说的，我们将用最质朴、最客观的文字书写有深度、有温度的科学。Journal Club，与你畅游Journal世界，和你共享科学蔚蓝。

细胞表面具有运动纤毛或鞭毛，其有节奏地摆动能够驱动液体流动。精子和单细胞真核生物的运动纤毛则使其具有游动能力。对人体而言，运动纤毛的动力不足会导致男性不育以及一种名为原发性纤毛运动障碍（primary ciliary dyskinesia，PCD）的先天性疾病，这种疾病使得纤毛清除黏液的能力受损，并引起慢性呼吸道感染¹。纤毛的运动由轴丝产生，这是一种由微管、ATP驱动的动力蛋白马达和调控复合物组成的分子机器²。时至今日，由于轴丝的尺寸和复杂性，其原子模型的发展以及对其功能运作的理解均面临着难题。

利用AI辅助结构预测以及冷冻电镜技术，美国哈佛医学院的Alan Brown作为通讯作者，于2023年5月31日在Nature期刊发表了题为“Axonemal structures reveal mechanoregulatory and disease mechanisms”的文章，解析了莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）鞭毛和人呼吸纤毛轴丝的96nm重复单元结构。其原子模型为轴丝的保守性和特异性、动力蛋白与其调控元件之间的关联性，以及维持轴丝周期性的机制提供了见解。此外，来自四个PCD患者的呼吸纤毛双微管结构揭示了单个对接因子的缺失如何选择性地消除周期重复结构。

运动纤毛的原型轴丝由双联微管（doublet microtubules，DMTs）围绕着中心两个单联微管圆柱形排列组成。DMTs会形成96nm的重复单元，之前的冷冻电子断层扫描（cryo-ET）研究认为这是动力蛋白马达和调控复合物相互连接的标志²。每个重复单元中有11个动力蛋白马达，根据他们的位置（内侧和外侧）以及重链（heavy chains，HCs）分为不同类型。每个HC包含一个由中间链（intermediate-chain，IC）连接的ATPase的头部结构域和一个螺旋尾结构域，以及一个轻链（light chain，LC）亚基。此外，一个96 nm重复单元中有6个不同的单头的内侧动力蛋白臂（IDAa–IDAe和IDAg），一个双头的内侧动力蛋白臂（IDAf）和4个多头的外侧动力蛋白臂（ODAs）。这些ODAs从近端到远端分别编号为1-4，以24nm为周期线性排列，首尾相接^3-5（如图1所示）。纤毛摆动时，停靠在一个DMT上的轴丝动力蛋白通过其马达结构域与相邻的另一个DMT互作并拉动它。ODAs提供了绝大部分的推动力，6个单头IDAs则被认为提供了DMT对之间的扭矩^6,7。轴丝动力蛋白的活动在轴丝两侧特定DMTs之间转换，这种转换是通过一种假设的机械调控途径，包括中央微管、DMT结合的T状辐条（radial spokes，RSs）、连接蛋白-动力蛋白调控复合物（N-DRC）和IDAf。

图1 莱茵衣藻轴丝纵切面原子模型

为了解析莱茵衣藻轴丝的重复模块结构，研究者们从展开的轴丝DMTs重构了冷冻电镜图。由于重复单元的大尺寸使得计算受限，该研究在重构纤毛完整的96 nm重复单元之前，通过对颗粒进行删减（subtraction）、优化（refinement）和分类（classification），从而聚焦于单个轴丝复合体。对于一些区域，这个方法使得结构的分辨率达到了4 Å以内，而另一些区域则分辨率较低，这是因为柔性削弱了排列颗粒的能力、制样过程中复合物缺失以及不对称性特征的平均化。

随后，结合从头建模、AI辅助结构预测、莱茵衣藻突变体的cryo-ET数据和先前研究中部分基于冷冻电镜数据的蛋白模型，以及中央微管的结构，该研究构建了目前最为完整的轴丝原子模型（图1和2）。此模型囊括了三种轴丝马达蛋白：三头ODA、负责调控的双头IDAf和所有的6个单头IDAs（IDAa-IDAe和IDAg）。

图2 莱茵衣藻轴丝横切面原子模型

其中，IDAf具有两个ATP酶驱动结构域（fα和fβ），但其在体外几乎没有动力。IDAf利用四个不同的锚，通过多点对接的方式附着在DMT上（图3a,b）。第一个锚与ODA1相连；第二个锚对应于内臂修饰蛋白（Modifier of inner arms，MIA），MIA是FAP73与FAP100的线圈状异源二聚体，分别与DMT表面接触；第三个锚对应于FAP57或其家族成员的二聚体，FAP57二聚体以四个β螺旋的堆叠方式与fα尾部接触；最后一个锚是系链-系链头（tether–tetherhead ，T/TH）复合物，是由两个结构相似的蛋白FAP43和FAP44缠绕形成的放射状结构。FAP43和FAP44的二聚化解释了为何其中一个元件基因消融都会导致突变纤毛中另一个元件的消失。FAP44的N端通过一对β螺旋结合在fα马达，而其C端则与FAP43形成螺旋卷曲并穿过DMT表面，最后停留在A和B小管的内部连接处。T/TH介导的IDAf与DMT的连接可能会在动力冲程周期限制IDAf的移动，并在活跃摆动的纤毛中发生构象变化。

图3 莱茵衣藻轴丝机械调控复合物的结构

如图3c,d，原子模型展示了11亚基N-DRC是围绕着长的分叉的螺旋卷曲构建的，它们在微管结合基底处的球状位置连接在一起，并在DRC3 N端富含亮氨酸重复（leucin-rich repeat，LRR）的区域分叉。分叉后，DRC1-DRC2和DRC4-DRC4螺旋卷曲向近端弯曲，按顺序为DRC7，DRC5和DRC11提供结合位点。11个亚基中的3个：DRC2、DEC4和DRC11，在N-DRC的近端形成一簇，含有至少60个赖氨酸（图3e）。此外，钙调蛋白（CaM）和/或钙调蛋白类似物DRC8亚基可以结合在界面附近DRC9至DRC11的IQ模体，意味着钙可能也参与相邻DMTs互作的调控。

图4 调控复合物调节动力蛋白之间的相互作用

除了接触相邻的DMT，IDAf和N-DRC还可以与ODAs以及IDAs互作，形成多种OIDLs，在协调96nm重复单元的轴丝动力蛋白活性过程中发挥调控作用。其中，IDAf可以接触ODA1和ODA2，N-DRC可以接触ODA3（如图4a）。每一个OIDL都由ODA核心的TCTEX异源二聚体（LC2-LC7）介导形成，意味着这个区域是一个关键的调控接触点。如图4b，ODA1通过IC140的β螺旋结构域和旁边f β的螺旋束与IDAf相连，这种连接在迄今为止所有轴丝的研究中都能被观察到，包括那些双头ODAs。第二个OIDL包括从MIA分支的FAP100的一个螺旋片段（图4c），若没有MIA，莱茵衣藻突变体会以较低的鞭毛摆动频率缓慢游动。这种减缓的游动能力是否由于减少的IDAf锚定情况或者OIDL2的缺失仍待进一步研究。如图4d，OIDL3包括N-DRC亚基DRC7的LRR结构域，而哺乳动物的DRC7同源蛋白缺少LRR结构域，意味着这个OIDL是藻类特有的。此外，DRC3的一个三螺旋束与IDAg马达的linker相接触（图4e）。动力蛋白马达的linker在动力脉冲时会弯曲，意味着DRC3和IDAg的互作可能会调控动力蛋白的活性。或者，这个互作可能会帮助定位或旋转IDAg马达，以改变其对相邻DMT的结合。对于IDAf，研究者们没有观察到其与IDAa有直接相互作用，尽管IDAf的TCTEX异源二聚体与其马达结构域的linker距离很近， 这意味着它们可以在纤毛摆动时互作。另外，研究者们对OIDL分析发现，IDAf和N-DRC具有多种构象，IDAf的核心区域可以相对DMT旋转6度，而N-DRC linker倾斜9度。在IDAf和N-DRC移动时，OIDL的保留使其伴侣ODAs的IC-LC和γ-HC马达均向前移动了约20 Å（图4f）。这一移动会打断ODA的γ-HC马达与其近端ODA尾部结构域的接触，从而呈现一种打开的状态，这也使得OIDL附近的γ-和β-HC倾向于分开。基于以上结果，该研究提出，在纤毛从近端到远端传播波形时，ODA之间接触断开所产生的纵向信号可能会激活ODAs簇。

图5 人轴丝96 nm重复单元的原子模型

为了探究轴丝的物种特异性，该研究利用冷冻电镜技术解析了人DMT的96 nm重复单元，其原子模型展示出比莱茵衣藻简化的辐条头部、颈部和基底（图5）。图中，RS3以CFAP61、CFAP91和CFAP251为基底构建而成，此基础上结合的蛋白还需要进一步实验鉴定。该模型表明了人源IDAf和ODA比在莱茵衣藻中具有更高的结构相似度，它们具有更少的额外亚基。人IDAf的TCTEX异源二聚体和IDAa马达结构域linker之间具有直接接触，可能提供了轴丝马达蛋白之间额外的信号传导途径。

此外，莱茵衣藻与人轴丝存在一个意想不到的区别，即其六个单头IDAs的组成和排列（图6a,b）。在此之前，人IDAf(DNAH2 and DNAH10)、IDAd (DNAH1) 和 IDAg (DNAH6)仅通过序列的保守性得到了推断，而该研究通过冷冻电镜确定了HC的分布以及对应的同源蛋白DNAH12（IDAa）、DNAH3（IDAc）与DNAH7（IDAb和IDAe）（图6c,d）。其中，IDAa、IDAc、IDAd和IDAg在两个物种中是相似的，最为保守的IDAs与RSs相关联。人IDAb和IDAe则具有不同于莱茵衣藻的结合位点。

图6 单头IDAs组成和位置的物种特异性

最后，该研究通过冷冻电镜技术探究了PCD相关的突变如何影响人轴丝的结构。研究者们从来自四位PCD患者的纤毛类器官中制备了轴丝。由于移码或无义介导的降解，这四种突变体均被证明或预测具有无效的等位基因，导致总蛋白缺失。所影响的蛋白在野生型轴丝（对照组）中的位置预测结果如图7c所示。每种突变均会导致纤毛无活力，具有较低的摆动频率和幅度以及异常的波形（图7a,b）。随后，该研究对患者的DMTs进行了结构解析，两个ODAD1突变体仅能拿到8nm的重复（图7d），发现其OAD-DC完全缺失。而CCDC39和CCDC40突变体的DMTs结构最高具有48nm的周期性，其没有可识别的96nm重复，也没有CCDC39或CCDC40螺旋卷曲（图7e）。在没有96nm规则周期的情况下，RSs仍然伸向轴丝，但仅偶尔结合DMTs。这些患者的DMT结构说明，对接因子的缺失可以导致周期性的完全丧失，尽管其组分（如RSs）仍存在于纤毛中。此外，研究发现轴丝24nm和96nm的周期性是独立的，一方的消失并不影响另一方的存在。

图7 PCD患者的DMTs结构

总而言之，研究者们通过冷冻电镜技术和AI辅助结构预测构建了莱茵衣藻和人轴丝96nm重复的原子模型，表明了轴丝在结构上具有保守性，但轴丝复合物具有物种特异性。其相似之处揭示了轴丝复合物与微管周期性对接以及机械调控感受器参与和调节动力蛋白的基础机制。而其不同之处则揭示了物种特异因素以及纤毛波形调整的调控机制。研究中的人源DMT模型为评估疾病突变的可能影响和致病性，以及为未解决的PCD确定新的候选疾病提供了宝贵的临床资源。

原文链接

https://www.nature.com/articles/s41586-023-06140-2

参考文献

参考文献

1.Legendre, M., Zaragosi, L.-E. & Mitchison, H. M. Motile cilia and airway disease. Semin. Cell Dev. Biol. 110, 19–33 (2021).

2.Ishikawa, T. Axoneme structure from motile cilia. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 9, a028076 (2017).

3.Bui, K. H., Yagi, T., Yamamoto, R., Kamiya, R. & Ishikawa, T. Polarity and asymmetry in the arrangement of dynein and related structures in the Chlamydomonas axoneme. J. Cell Biol. 198, 913–925 (2012).

4.Kubo, S. et al. Remodeling and activation mechanisms of outer arm dyneins revealed by cryo-EM. EMBO Rep. 22, e52911 (2021).

5.Walton, T., Wu, H. & Brown, A. Structure of a microtubule-bound axonemal dynein. Nat. Commun. 12, 477 (2021).

6.Sakakibara, H., Kojima, H., Sakai, Y., Katayama, E. & Oiwa, K.Inner-arm dynein c of Chlamydomonas flagella is a single-headed processive motor. Nature 400, 586–590 (1999).

7.Kamiya, R. & Yagi, T. Functional diversity of axonemal dyneins as assessed by in vitro and in vivo motility assays of Chlamydomonas mutants. Zool. Sci. 31, 633–644 (2014).

供稿 | 张颖

审稿 | 田露

责编 | 囡囡

排版 | 可洲

精彩回顾

精彩回顾

点击上方卡片

关注我们吧

THE END

我知道你“在看”哟