Cell | 海胆和牛精子双联微管结构的解析揭示修饰与功能的关系

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受精卵作为自然界有性生殖物种生命的起点，是精子“翻山越岭”与卵子相会的结果。在哺乳动物中，精子需要游动大于其自身长度1000倍的距离，同时需要克服流体的黏度、剪切力以及物理屏障¹。因此，精子的运动能力关乎着受精过程的顺利进行。精子运动能力的缺陷会导致男性不育，这在全球范围内呈现上升趋势，使得辅助生育技术的需求日渐增加^2,3。

精子的游动由轴丝驱动，轴丝是基于微管的分子机器，由上百种不同蛋白组成，包括负责驱动的动力蛋白马达和调节游动的大量调控蛋白。轴丝的微管由9个双联微管（doublet microtubules，DMTs）围绕着中间的一对单联微管（singlet microtubules）组成，负责驱动和调控的蛋白锚定在微管上。目前，小鼠和人的精子DMTs结构已得到解析^4-6，但不同物种微管如何通过修饰以支持不同受精环境下的运动，目前仍不清楚。2023年6月15日，荷兰乌德勒支大学的Tzviya Zeev-Ben-Mordehai和美国华盛顿大学的Rui Zhang在Cell发表了名为“Structural specializations of the sperm tail” 的文章，解析了海胆和牛精子的轴丝双联微管结构，对比了体外受精和体内受精两种生殖方式中微管修饰的区别，为从分子水平上理解精子进化、运动及功能障碍提供了结构基础。

尽管轴丝在进化上高度保守，其在不同的物种和细胞类型之间具有结构的差异。一个尤其不同的特征是其修饰轴丝DMTs边缘并在摆动时稳定结构的微管内部蛋白（microtubule inner proteins，MIPs）。MIPs与不同的重复长度结合，这些重复长度是8 nm微管蛋白重复的倍数，具有48 nm的总周期性，与外部轴丝复合物的96 nm周期性一致。哺乳动物精子DMTs比衣藻鞭毛或哺乳动物呼吸纤毛有更多的MIPs，但其组成成分未知。

精子的自然多样性展现了生命树生殖模式的多样化，是研究轴丝进化的良好选择。例如，广播产卵的海洋生物的精子细胞需要在广阔的海水中航行，而体内受精的物种需要精子在雌性的生殖道游走。这种不同的环境压力会引起结构的进化，从而支持精子的游动（图1A,B）。如同哺乳动物和其它羊膜动物等，体内受精的生物精子尾部具有大的附属结构，像外周致密纤维（outer dense fibers，ODFs）和纤维鞘，它们可以抑制在高黏度流体中轴丝的弯曲。相反，如海胆和斑马鱼的体外受精生物，其精子尾部基本由质膜包裹的轴丝形成。然而，不同物种之间轴丝的核心微管装置如何变化仍不清楚。对此，研究者们将海胆精子去膜并制备了冷冻样品（图1C）。对于牛的精子细胞，研究者们去膜后除掉了线粒体鞘，并用ATP诱导微管移动。没有了线粒体鞘的限制，DMTs从中间脱落的同时依旧附着着各自的ODFs，使得轴丝分解并暴露出DMTs，利于冷冻样品的制备和结构的解析（图1D）。通过冷冻电镜技术，该研究解析了海胆和牛的精子DMTs结构，鉴定了超过60种修饰精子DMTs的MIPs和微管结合蛋白（microtubule-associated proteins，MAPs）。通过对比不同物种和细胞类型之间的结构差异，研究者们分析了轴丝DMT的进化并阐释了核心分子装置的基本结构准则。

为了重构海胆和牛精子的48 nm DMT重复序列，研究者们采用了莱茵衣藻鞭毛和哺乳动物呼吸道纤毛结构解析的策略。首先，研究者们以8 nm为周期沿着微管提取了颗粒，然后在内部连接处对MIPs进行了3D分类，以得到16 nm颗粒。随后，对结合在管缝处的MIPs进行了第二轮3D分类，得到了48 nm颗粒。通过进一步的优化，海胆和牛精子DMTs的整体分辨率分别可达3.3 Å和3.6 Å。

图1 精子轴丝双联微管原位冷冻电镜图像

为了鉴定结合在DMTs的蛋白，该研究采取了质谱分析和三种不同的策略。第一个策略是构建聚丙氨酸骨架模型，随后用findMySequence从精子蛋白组鉴定出最有可能的候选蛋白。第二个策略是采用ModelAngelo或DeepTracer从图谱自动构建模型，随后将预测的序列与序列库进行比对。第三种策略则是用于具有球形结构域的蛋白，其依赖于基于结构的方法，将骨架输入到DeepTracer-ID或DALI服务器，在PDB或AlphaFold2数据库中搜索。最佳结果将突变为聚丙氨酸，重新到密度图谱，然后做findMySequence。通过这些策略，该研究鉴定了超过60种修饰精子DMTs的蛋白并构建了原子模型，这些蛋白包括MIPs和MAPs（图1E,F）。

通过与衣藻鞭毛及哺乳动物呼吸纤毛DMTs的结构进行对比，该研究定义了25个存在于所有结构的核心MIPs（图2A,B）。同时，该研究还鉴定了海胆和牛精子特异的MIPs，以及在两个物种中保守的MIPs。在此，研究者们将只在精子DMTs中存在的精子相关（sperm- associated）的MIP或MAP分别命名为SPMIP或SPMAP，将精子和气管DMTs中均存在的MIP或MAP分别命名为CIMIP或CIMAP。

如图2D所示，牛的精子拥有比海胆更多的MIPs，二者B管的修饰也明显不同，哺乳动物精子有SPACA9条纹，而海胆精子有尚未鉴定的MIPs伸向管腔。除了精子特异的MIPs外，哺乳动物精子DMTs几乎保留了所有存在于呼吸纤毛DMTs的MIPs，除了CIMIP2B（FAM166B），它在睾丸中表达水平较低，且在精子中被CIMIP2A（FAM166A）替换（图2C）。

图2 不同物种和细胞类型的DMTs结构对比

哺乳动物精子DMT的特征是其复杂的筑丝蛋白（tektin）束几乎填满了整个A管（图3A）。筑丝蛋白是一种丰富的纤毛蛋白，可以在轴丝DMT中形成超稳定的细丝。在哺乳动物中发现的5种的不同的tektin，有4种在呼吸纤毛中形成了五边形的八个tektin束（图3B），而第5种tektin，即Tektin-5，只在睾丸中表达。Tektins对精子的动力和男性的生育能力至关重要。结构表明，哺乳动物精子中额外的tektin超复合物（命名为sickle）是由多个睾丸特异的Tektin-5形成，它们根据位置和组织可分为七组（TEKT5-A—TEKT5-G）。TEKT-A，-B，-C以头尾相接的方式形成了具有16 nm周期性的连续细丝（图3E），这与tektins 1-4在呼吸纤毛中相似。而TEKT-D至TEKT-G则具有意想不到的构象和组织。TEKT-G具有48 nm的周期性且不形成细丝，TEKT-F则与tektin束呈对角线垂直结合，每16 nm具有一个重复，形成了sickle（图3A,E）。Tektin-5的结构多样性似乎其它MIPs阻止N端1A螺旋以及L12和L2环正确排列的结果，这些是典型细丝形成所需要的。在TEKT5-F中，其1A螺旋往回折叠到中央螺旋束上，并被N端与TEKT3-1和CIMIP2A（FAM166A）形成的分子间β片层固定在原位（图3F）。TEKT5在哺乳动物精子DMTs中的重要性阐明了其对男性生育能力的重要意义。TEKT5的杂合缺失与无精子症相关，且小鼠TEKT5水平的降低会影响精子的产生。这些结果表明TEKT5在精子尾部的组装和稳定中都具有重要作用。

通过对比精子和呼吸纤毛DMT的结构发现，tektin束的组织形式在同一物种的不同细胞类型中会有实质性的变化。为了探究tektin的组织在纤毛生物中如何变化，研究者们分析了海胆精子DMT的冷冻电镜结构，其含有海胆四个tektin基因中的三个（图3C）。三个海胆tektins（被称为TEKT-A，-B和-C，分别对应于哺乳动物的TEKT4，TEKT2和TEKT1）形成了一个相对简单的紧密结合的TEKT4和TEKT2异源二聚体细丝，以及一个更松散结合在带状物（原丝A12-A01）的TEKT1细丝（图3C）。TEKT1，TEKT2和TEKT4纤维在海胆精子、哺乳动物精子以及哺乳动物呼吸纤毛中的位置和排列几乎一致（图3A-C）。这些tektin束的核心细丝通过与其它MIPs互作被招募到带状物，随后向外扩展到A管管腔。

图3 Tektin束的进化和结构扩展

为了研究tektin的进化，研究者们解析了莱茵衣藻结合了tektin的DMT结构，其保留了只有一个tektin基因的原始状态（图3D）。结构表明，衣藻tektin结合在B管并组装为9根细丝，形成了喙状结构。典型的tektin折叠、头尾相接聚合以及细丝组装为更大的复合物在衣藻中均很保守，意味着这些特征可能存在于原始的tektin中。然而，衣藻tektin主要和β微管蛋白互作，而不是像后生动物tektins主要与α微管蛋白互作。

此外，结构还表明CCDC105是一个保守的、精子特异的类tektin分子，它在原丝A11和A12之间的缝隙形成了细丝，并结合了多个核心MIPs和精子MIPs（图3A,C和图4）。CCDC105的三级结构与tektins相似，但相当于tektin 1A螺旋裂成了两个螺旋（称为1A′和1A′′），并被一个环（L1′）隔开。基于这种结构相似性，研究者们将CCDC105重新命名为了“tektin-like 1”（TEKTL1）。TEKTL1和tektins组装成细丝的机制有细微的差异（图4C，右侧）。与tektin相似，相邻TEKTL1分子的主要接触点是从中央束伸出的螺旋臂。然而，TEKTL相当于L12的环并不夹在相邻分子的L12环，而是环在同一个原体的1A′′螺旋附近（图4C）。TEKTL1原体间的相互作用可能由SPMIP10（TEX43）进一步稳定，它在与原丝A11和A12相互作用的同时支着TEKTL1的分子间界面（图4A,B）。但目前只知道TEKTL1在睾丸中高度表达，在精子尾有结构缺陷的小鼠中下调，对其功能知之甚少。

图4 TEKTL1是一个保守的类tektin精子MIP

与ARL6IP1的泛素化相关

与tektins相似，轴丝微管稳定蛋白（stabilizer of axonemal microtubules，SAXO）家族在轴丝DMTs以及神经元和寄生虫的稳定微管中普遍存在。SAXO蛋白的定义特征为Mn模体（ motif），它形成了5-6氨基酸螺旋，一端是Tyr或Phe结尾，另一端是Ser或Thr结尾并结合了α微管蛋白S9/S10环。研究者们利用这些特征在DMT 48 nm重复序列的每一个可能的微管蛋白结合位点系统性搜索了SAXO蛋白（图5）。分析发现，SAXO蛋白非常广泛分布。在牛和海胆精子中，SAXO蛋白分别结合了19/23和18/23的原丝（图5A,B），而衣藻DMTs的SAXO蛋白结合了14个原丝。此外，研究者们发现SAXO蛋白结合了牛精子末端单联微管的13个原丝（图5C）。

根据结合微管蛋白的方式，研究者们将SAXO蛋白分为了三类。第一类SAXO通过单个Mn motif结合（图5D）。尽管先前实验表明单个Mn motif在体外足以与微管结合，该研究所解析的结构明确展示了蛋白确实通过单独的Mn motif与微管相互作用。第二类具有多个Mn motifs，可以沿着单个原丝纵向结合（图5E）。这类蛋白的Mn motif间隔大约40个氨基酸，对应了明显的内部8 nm重复。基于存在多个SAXO motifs，研究者们将这类中未表征的两个成员分别重新命名为SAXO4（PPP1R32）和SAXO5（TEX45）。SAXO5在这类中尤其显著，因为其具有11个Mn motifs（图5G），因此具有96 nm的周期性，与轴丝的外部周期性一致。第三类蛋白也具有多个Mn motifs，可以结合相邻的原丝（图5F）。Mn motifs在不同物种间比较保守，即使在具有一个或两个motifs的蛋白中也是如此。

因此，该研究的结构分析扩展了SAXO蛋白家族并建立了Mn motif作为MIPs中普遍存在的微管结合模式。仅含有Mn motif的最小结构体足以在体外或细胞培养环境中稳定微管，修饰精子DMTs的大量SAXO蛋白可能在精子运动时稳定了微管蛋白。

图5 Mn motif是一个通用的微管结合motif

此外，该研究所解析的解析的结构也揭示了保守的轴丝MAPs几乎结合了精子DMTs所有的原丝（图6）。研究者们鉴定了ODF3或类ODF3（ODF3L）蛋白结合在原丝A05-A07，A08/A09以及B01-B07之间（图6A,B）。ODF3家族因为免疫金标记显示它们定位于哺乳动物精子的ODFs，从而得以命名。然而，该研究发现海胆的ODF3同源蛋白缺少了附属物（图6A），表明了ODF3家族是DMTs真正的MAPs，尽管ODFs的第二个角色还无法下定论。由于这些蛋白也存在于缺少ODFs的精子以及其它纤毛细胞类型中，研究者们将它们重新命名为CIMAP1。

与其它具有结构特征的MAPs相比，CIMAP1，CIMAP2，CIMAP3和CFAP96具有不同的微管结合模式（图6C）。轴丝MAPs结合在原丝间缝隙的深处，并且与侧翼的原丝有广泛接触。轴丝MAP SPMAP2也具有独特的微管结合方式，即横向穿过B管的多个原丝（图6A,B）。SPMAP2沿着α/β微管蛋白的互作界面结合，并周期性地进入原丝间缝隙（图6C）。另外，轴丝MAP CFAP97D1特异地结合外部连接处（图6D），为24 nm重复并由linker连接四个螺旋组成（图6E）。

图6 轴丝微管结合蛋白MAPs通过独特的微管结合模式与DMTs互作

哺乳动物精子具有大的ODFs包裹轴丝并使之变小。研究者们发现，DMT-ODF复合物中，ODFs通过外围的丝状亚结构与DMT结合（图7A）。利用三维分类，研究者们富集了在轴丝MAPs缝隙处的DMTs，从而鉴定了三个额外的哺乳动物精子特异蛋白：EFCAB3，SPMAP1和睾丸特异性丝氨酸/苏氨酸激酶6（TSSK6）（图7B,C）。这些蛋白具有24 nm周期性，TSSK6和SPMAP1在接缝处直接与微管互作（图7B,C）。TSSK6可能会磷酸化ODF组分作为精子获能的响应。精确挖掘TSSK6如何与ODF组分互作仍然是未来结构工作的重要方向。

图7 TSSK6是哺乳动物精子中连接DMTs和外部致密纤维（ODFs）的缝结合轴丝MAP

总之，该研究通过冷冻电镜技术解析了不同物种和细胞类型的DMTs共有的特征，鉴定了25个存在于迄今为止所研究的所有DMTs中的核心MIPs。这些核心MIPs可能在DMTs组装或者维持其特化结构中发挥着基础作用。此外，该研究还揭示了SAXO蛋白是轴丝DMTs的普遍特征，其motif存在于核心和细胞特异的MIPs中。研究中所解析的结构也拓展了大家对于MAPs修饰轴丝DMTs外表面的理解。这些结构的解析从分子水平上为精子尾部和tektin束等的进化以及功能维持的理解提供了基础。

原文链接

https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(23)00576-7

参考文献

参考文献

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供稿 | 张颖

审稿 | 田露

责编 | 囡囡

排版 | 可洲

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