Science｜冷冻电镜揭示RNA调控PRC2的“幕后故事”
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细胞核是细胞储存遗传物质的保险箱，细胞核内的许多蛋白既可以结合染色质，也可以结合RNA分子1-3。RNA的结合被认为可以促进正调控和负调控，分别体现为招募至靶向位点和抑制酶活。多梳蛋白抑制复合物2（polycomb repressive complex 2，PRC2）是已知受RNA调控的染色质修饰因子4,5，对胚胎发育和细胞分化至关重要6,7。PCR2通过组蛋白H3K27的三甲基化沉默基因，若肿瘤抑制基因沉默，会使肿瘤具有PRC2依赖性，因此PRC2为癌症治疗的一个靶点8。PCR2能与多种前体信使RNA（precursor messenger RNAs，pre-mRNAs）以及长非编码RNA（long noncoding RNAs，lncRNAs）结合，且对富含鸟嘌呤的G-四链体RNA（G-quadruplex RNA）有结合偏好性。在过去的十年间，pre-mRNAs和lncRNAs在PRC2调控相关的探讨中日渐突出。然而，现有研究提出了多种RNA调控PRC2的模型，观点各不相同，因此需要更多PRC2与RNA互作的结构细节来提供机制层面的见解。
2023年9月22日，来自美国科罗拉多大学博尔德分校的两位通讯作者Thomas R. Cech和Vignesh Kasinath带领其团队在Science期刊发表了题为“Structural basis for inactivation of PRC2 by G-quadruplex RNA”的研究成果。该研究利用冷冻电镜解析了PRC2结合G-quadruplex RNA的结构，表明了RNA能够介导PRC2的二聚化，从而阻断与核小体DNA的互作以及组蛋白H3尾部的进入。这一结果揭示了RNA介导调控染色质修饰酶PRC2的相关机制。
PRC2具有四个核心蛋白组分：催化亚基EZH2、结合组蛋白H3K27me3（27位赖氨酸三甲基化）的EED、提供平台的SUZ12和RBAP48。根据结合的辅因子， PRC2被定义为两个亚类，含有AEBP2和JARID2的PRC2.2是该研究的主题。
如图1A和1B所示，研究者们准备了含有全长核心亚基与较短亚型AEBP2和截短JARID2119-450的六亚基PRC2.2复合物，以及两个能够体外结合PRC2的G4型RNA。通过使用链霉亲和素-生物素亲和电镜载网（streptavidin-biotin–affinity EM grid），研究者们捕获了5′端生物素标记的RNA，并从过量的PRC2中选择性地得到了结合了RNA的PRC2复合物。从负染电镜结果来看，颗粒数与RNA浓度成正比（图 1C）。与未结合RNA的PRC2相比，结合了RNA的PRC2复合物明显更大（图 1D）。从二聚PRC2结合一个G4 RNA 的结构来看，核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP）复合物中两个PRC2原体几乎一致，且具有先前表征的SANT1伸展构象（图 1E）。在RNA诱导的二聚体中，研究者们鉴定了一个蛋白互作界面，即局部的EZH2-EZH2互作界面（后续称为二聚体界面）。在G4密度更强的一侧，两个PRC2原体的距离缩短，解释了其不完美的对称性，并支持了单一G4不足以促进PRC2二聚化的模型。尽管在样品制备时，大多RNPs的PRC2与RNA的化学计量比为2:1，但无法否认存在一个PRC2二聚体同时结合两个G4 RNAs的可能。
图1 PRC2-1G4 RNP复合物结构
为了验证PRC2二聚化对结合G4 RNA的依赖性，研究者们进行了体积排阻色谱（size-exclusion chromatography）和质谱分析。如图2所示，没有RNA时，六亚基PRC2复合物以单体的形式存在，分子量约340 kDa。与18-kDa 1G4或30-kDa 2G4 RNA孵育后，形成了约720 kDa的RNP复合物，与二聚体的分子量大小相近。
在PRC2-1G4 RNA二聚体中，有三个特征可能会抑制核小体的结合和组蛋白的甲基化。首先，EZH2的CXC结构域中的氨基酸与另一个原体的CXC形成了二聚体界面。这个界面含有氢键和疏水相互作用（图 3A）。核小体结合PRC2时，CXC结构域促进了EZH2中相邻SET结构域的催化活性，参与二聚体界面的氨基酸在此处则促进了PRC2与核小体DNA以及组蛋白H3尾部的互作（图 3B）。通过将本结构的密度图谱与核小体结合的PRC2进行叠加，可以看到密度与DNA和H3尾部有冲突，表明了CXC结构域在这些不同的PRC2结构中具有不同的功能（图 3C）。因此，研究者们提出，核小体的结合以及H3尾部的插入作为组蛋白甲基转移酶（HMTase）活性所必需的，与RNA介导的PRC2二聚化相互拮抗。随后，核小体-PRC2复合物能够被1G4 RNA破坏在溶液环境的竞争结合实验中得到了证实（图 3D）。
图2 G4 RNA在溶液中诱导PRC2二聚化
为了探究CXC二聚界面的重要性，研究者们对界面互作相关氨基酸进行了突变，并纯化了突变蛋白。实验发现，这些突变并不影响G4 RNA的结合，也不能阻止RNA诱导的二聚化。然而，如图3E所示，负染电镜发现突变型蛋白在链霉亲和素-亲和载网上相比于野生型蛋白具有更多的单体大小颗粒（野生型约有9%，突变型约有59%）。意味着这些突变使得蛋白间相互作用变得不稳定，从而影响了PRC2二聚体的整体稳定性，因此在样品制备过程中更容易解聚成为单体。
随后，研究者们想要将CXC互作界面破坏的更彻底，便将这些氨基酸突变为了酪氨酸。然而，他们意外地发现，这些突变增强了对G4 RNA的结合亲和力（图 3F，左）。值得注意的是，这一突变型对双链DNA的结合并未受到影响（图 3F，中和右），进一步表明了DNA和RNA结合PRC2的机制完全不同，尽管它们的结合相互拮抗。
在EZH2 CXC互作界面观察到的这些结构促使研究者们提出了一个假设，即G4诱导的PRC2二聚体的HMTase活性会受到抑制。为了验证这一想法，研究者们对游离PRC2和RNA结合的二聚体进行了活性实验比较（图 3G）。正如研究者们所想，RNA的结合使所有底物的甲基化水平均降低，且亲和力更高的2G4 RNA会使抑制更强（图 3G）。抑制的程度受限于RNA浓度，过量的1G4 RNA便可以实现完全抑制（图 3H）。
图3 RNA介导的PRC2二聚体是一个非活性复合物
如图4A所示，在EZH2中，研究者们鉴定了多个与G4 RNA有接触的氨基酸。PRC2具有将RNA直接替换为DNA的能力，并不需要一个游离酶的中间态。研究者们因此探究了EZH2富含精氨酸的区域以及其结合RNA的能力，对这种RNA到DNA的替换是否重要。研究发现，对富含精氨酸区域进行截短或局部电荷反转，会使RNA转为DNA的倾向性分别减少4.3倍和增加2.7倍（图 4C）。研究者们认为，PRC2利用富含精氨酸的区域和富含赖氨酸的区域与RNA和DNA形成了三元中间态，对RNA结合区域的两种处理则从不同方向影响了RNA的直接替换。
图4 EZH2 loop与G4 RNA直接接触，并有助于RNA到DNA的直接替换
随后，研究者们利用斑马鱼测试了EZH2 G4 RNA结合位点对于脊椎动物发育的意义。斑马鱼与人的EZH2蛋白具有高度的序列一致性，包括与G4 RNA结合以及RNA诱导的PRC2二聚化相关的区域。研究发现，敲降EZH2会引起严重的生长缺陷，表现为前后轴长度的极端变化（图 5A）。而注射了编码人源野生型EZH2的mRNA后则会挽救这种生长缺陷（图 5B）。此外，电荷反转同样有挽救效果，这意味着体外实验中表现出的RNA到DNA替换倾向的增加，在斑马鱼发育过程中同样表现为功能获得性突变。
图5 EZH2电荷反转对于挽救斑马鱼的发育是一种功能获得性突变
总之，该研究利用了链霉亲和素-生物素亲和电镜载网（streptavidin-biotin–affinity EM grid），用生物素标记RNA并捕获结合了RNA的核糖核蛋白。研究者们发现，结合RNA后，PRC2可以二聚化，其蛋白互作界面由EZH2 CXC结构域组成。结构的解析为RNA如何抑制PRC2提供了分子层面的解释，并表明了RNA促进PRC2招募的机制。
原文链接
https://www.science.org/doi/full/10.1126/
science.adh0059
参考文献
参考文献
1. D. G Hendrickson, D. R. Kelley, D. Tenen, B. Bernstein, J. L. Rinn, Genome Biol. 17, 28 (2016).
2. Y. Long, X. Wang, D. T. Youmans, T. R. Cech, Sci. Adv. 3, eaao2110 (2017).
3. R. Xiao et al., Cell 178, 107–121.e18 (2019).
4. C. Davidovich, T. R. Cech, RNA 21, 2007–2022 (2015).
5. J.Yan,B.Dutta,Y.T.Hee,W.J.Chng,RNA Biol. 16,176–184 (2019).
6. R. Cao et al., Science 298, 1039–1043 (2002).
7. R. Margueron, D. Reinberg, Nature 469, 343–349 (2011).
8. A. Laugesen, J. W. Højfeldt, K. Helin, Cold Spring Harb. Perspect. Med. 6, a026575 (2016).
供稿 | 张颖
审稿 | 田露
责编 | 囡囡
排版 | 可洲
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