Nature｜单胺类神经递质如何转运至囊泡，VMAT2的结构解析
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单胺类神经递质，比如像多巴胺、血清素、去甲肾上腺素、肾上腺素和组胺，调控着重要的神经回路，包括运动、睡眠、奖励和情绪等【1】。单胺能神经回路的功能障碍与各种神经退行性和神经精神疾病有关【2】。囊泡单胺转运蛋白（Vesicular monoamine transporter，VMAT）负责将突触前神经元合成的单胺从细胞质转移至囊泡内，以供后续在突触间隙中释放【3】。
VMAT属于SLC18转运体家族的成员，通过利用质子梯度反向转运底物【4】。VMAT有两个亚型，分别是VMAT1（SLC18A1）和VMAT2（SLC18A2）。VMAT1主要表达在外周神经分泌细胞中，而VMAT2则广泛分布于神经元中【5】。由于在神经系统中的重要作用，VMAT2在临床上已经被作为高血压、亨廷顿舞蹈症等疾病的潜在治疗靶点。VMAT2特异性抑制剂丁苯那嗪（TBZ）已经被FDA批准用于治疗亨廷顿舞蹈症【6】。另外一个VMAT2抑制剂利血平（RSP）是最早用于治疗高血压的药物，但由于潜在的副作用已退居二线药物【7】。值得注意的是，两个抑制剂的抑制机制并不相同，TBZ是非竞争性抑制剂，而RSP是竞争性抑制剂；TBZ是特异性VMAT2抑制剂，而RSP可以抑制两种亚型VMAT1和VMAT2【8】。所以，VMAT的底物转运和药物抑制的分子基础仍然需要结构信息来进行解释。
2023年11月2日，美国圣裘德儿童研究医院李佳学课题组和北京大学生命科学学院张哲课题组合作在Nature杂志发布了题为“Mechanisms of neurotransmitter transport and drug inhibition in human VMAT2”的研究论文。通过冷冻电镜解析了VMAT2蛋白分别与非竞争性抑制剂丁苯那嗪（Tetrabenazine，TBZ）、竞争性抑制剂利血平（reserpine，RSP）、内源底物5-羟色胺（5-HT）结合的结构，揭示了两种抑制剂不同的作用模式以及底物转运的分子机制。
首先，作者解析了VMAT2与非竞争性抑制剂TBZ的结构，分辨率为2.9 Å（图1a），发现VMAT2呈现向腔内开口的状态（图1b），TBZ位于VMAT2的TM1、4、7、10形成的中央口袋处（图1c），分析胞质侧和腔内侧的侧链，发现都将中央口袋与两侧的通道阻塞住（图1c），因此作者认为TBZ将VMAT2稳定在向腔内开口的阻塞状态，从而抑制VMAT2转运。分析TBZ与中央口袋残基的相互作用（图1d和1e），这些关键氨基酸残基的突变都会造成TBZ与VMAT2的结合减弱（图1f）。
图1 VMAT2与TBZ结合的结构
作者发现，当细胞裂解后，膜上的VMAT2不再结合RSP（图2a），作者推断没有跨膜质子梯度后，VMAT2可能被稳定在了无法结合RSP的构象中。作者通过引入胞质侧门控氨基酸突变Y418S，使得VMAT2在没有质子梯度的情况下仍然可以结合RSP（图2a）。随后便解析这一突变体与RSP的结构，分辨率为3.2 Å（图2b）。发现RSP将VMAT2稳定在了向胞质开口的构象（图2c），使得中央口袋和胞质侧间的通道开放（图2d）。这一结构也表明RSP可以直接与底物在进入VMAT2的通道时起到竞争作用。分析TBZ与RSP的结合模式（图2e），可以发现TBZ分子长轴的取向与膜平面平行，而RSP分子长轴的取向与跨膜螺旋平行，并且相互作用氨基酸残基也差距较大，只有少部分重叠（图2f）。作者将这些相互作用氨基酸突变体进行功能研究（图2g），发现大侧链疏水氨基酸如F335，I395和F249突变会降低RSP结合，与RSP分子内的圆环基团作用的氨基酸如N34，L225和M403突变也会降低RSP结合。
图2 VMAT2与RSP结合的结构
为了研究VMAT2与底物的识别与转运机制，作者解析了VMAT2与底物5-HT的结构，为向胞质开口的状态（图3a），5-HT位于中心口袋处，底物的氨基与E312存在相互作用（图3c），提示了VMAT2对于单胺类底物的通用识别模式。5-HT与RSP的吲哚基团结合位置较为接近（图3d），一定程度上解释了RSP竞争性抑制VMAT2转运底物5-HT。底物结合位点关键氨基酸的突变会造成VMAT2转运底物能力下降（图3e）。通过比较VMAT2结合RSP和5-HT的结构可以发现，RSP使得胞质侧开口更大（图3f和图3b），可能暗示着RSP结合后会扩张VMAT2，并将其稳定在这一扩张的状态，并阻止构象变化。
图3 VMAT2与5-HT结合的结构
综上，作者提出了VMAT2转运底物及抑制剂抑制机制的模型（图4）。VMAT2利用质子浓度梯度反向转运底物5-HT；TBZ会在VMAT2处于向腔内开口时结合，然后将其稳定在向腔内阻塞的状态；RSP会在VMAT2处于向胞质开口时结合，然后将其稳定在向胞质开口更为扩展的状态。
图4 VMAT2转运底物及抑制剂抑制机制的模型
原文链接
https://doi.org/10.1038/s41586-023-06727-9
参考文献
参考文献
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【2】Ng, J., Papandreou, A., Heales, S. J. & Kurian, M. A. Monoamine neurotransmitter disordersclinical advances and future perspectives. Nat. Rev. Neurol. 11, 567–584 (2015).
【3】Yaffe, D., Forrest, L. R. & Schuldiner, S. The ins and outs of vesicular monoamine transporters. J. Gen. Physiol. 150, 671–682 (2018).
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【5】Weihe, E., Schäfer, M. K., Erickson, J. D. & Eiden, L. E. Localization of vesicular monoamine transporter isoforms (VMAT1 and VMAT2) to endocrine cells and neurons in rat. J. Mol. Neurosci. 5, 149–164 (1994).
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【7】Fraser, H. S. Reserpine: a tragic victim of myths, marketing, and fashionable prescribing. Clin. Pharmacol. Ther. 60, 368–373 (1996).
【8】Erickson, J. D., Schafer, M. K., Bonner, T. I., Eiden, L. E. & Weihe, E. Distinct pharmacological properties and distribution in neurons and endocrine cells of two isoforms of the human vesicular monoamine transporter. Proc. Natl Acad. Sci. USA 93, 5166–5171 (1996).
供稿 | 朱盎岐
审稿 | 李浩田
责编 | 囡囡
排版 | 可洲
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