Nature | FIB-SEM结合VAPB分子成像——细胞器互作的三维动态观

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内质网 (ER) 和线粒体之间的接触位点 (ER-mitochondria contact site, ERMCS) 是哺乳动物细胞中最为常见的细胞器接触位点¹。其在哺乳动物细胞包括脂质代谢、钙信号传递和细胞呼吸等生物学过程中发挥广泛的作用²。然而，由于成像技术的局限性，且细胞的化学固定通常会造成不可避免的伪影³，我们对ERMCS动态的结构及调控始终缺乏清晰的认知。

2024年1月24日，来自HHMI的Jennifer Lippincott-Schwartz团队在Nature上在线发表了题为Motion of VAPB molecules reveals ER-mitochondria contact site subdomains的科研论文，结合三维电子显微镜和活细胞、高速单分子成像定量成像的方法，对不同生理和病理状态下ERMCS及其内部分子的动态变化进行了描述。

Jennifer团队长期致力于利用光电联合技术，在纳米级的尺度对细胞内的超微结构及其动态性进行观察。在2021年，利用FIB-SEM、cryo-SIM及新的图像分割和机器学习算法，其团队对全细胞内部的细胞器进行了识别和完整的三维重构⁴。在本文所涉及的这项工作中，研究者同样采用了FIB-SEM，对样品进行高压冷冻、冷冻置换、FIB减薄及逐层电子层扫，对ER和线粒体之间的接触部位进行重构 (图1)。在此技术上，结合针对VAPB分子的活细胞单分子成像，对接触位点的动态性进行了进一步阐述。

图1. 利用FIB-SEM对ER和线粒体之间的接触部位进行重构

ERMCS通常由成对的跨膜蛋白介导，其中一种便是VAPB (ER-localized vesicle associated protein (VAMP)-associated protein B)⁵，该蛋白能够与其位于线粒体上的结合蛋白 (如线粒体外膜组分PTPIP51) 互作⁶。在本文中，研究者通过FIB-SEM对COS7细胞局部的内质网和线粒体进行了三维重构，将距离线粒体外膜 (outer mitochondrial membrane, OMM) 24 nm的内质网膜区域识别为ERMCS，发现这一结构在FIB-SEM的重构结果中异常丰富，通常位于线粒体嵴的脊部附近或OMM的收缩区域 (视频1)。

视频1

为了在活细胞中对ERMCS进行动态表征，研究者使用sptPALM (single particle tracking-photoactivation localization microscopy) 对单个VAPB分子的运动进行记录 (视频2)。在对VAPB的追踪中，研究者观察到了与空间高度相关的轨迹簇。通过将特定时间窗口内的所有轨迹转换为空间定义的概率函数，这些与空间相关的轨迹被认为是VAPB所定位的内质网区域，且这些概率“热点”的大小与类似空间分辨率下FIB-SEM中ERMCS的大小一致。

视频2

除了在活细胞中提供ERMCS的超分辨率图像外，本文基于sptPALM的方法还允许研究者对单个VAPB分子与ERMCS随时间的相互作用进行分析。并非所有遇到接触位点的VAPB分子都表现出直接接触，并且在单个细胞中，接触的概率在ERMCS之间也是不稳定的。VAPB分子只在接触位点内停留了很短的时间，大多数分子在毫秒时间尺度上离开了接触位点 (视频3, 图2a-d)，比过去研究报道的内质网与质膜接触位点上的分子交换速度快了近10倍。

视频3

研究者进一步采用一种非参数贝叶斯方法对这些瞬时相互作用进行进一步量化，在图2e、2f中，蓝色代表在内质网中进行自由扩散的部分，红色代表与接触位点相关联的部分，在对多个细胞中的接触位点进行分析时，研究者发现，相比于周围管状ER中的VAPB分子，ERMCS中的VAPB分子表现出明显降低的扩散 (D_eff)，但仍存在明显的扩散运动特征，表明接触位点内部的VAPB分子仍然存在动态运动。

图2. VAPB分子的动态扩散

在长达60-90的成像过程中，许多单独的VAPB分子与接触位点界面存在反复的接触。为了进一步探究该界面上的扩散情况，研究者将接触位点进一步分隔更小的区域，并对每个邻近区域内的轨迹段的平均扩散进行分析。在每个稳定的接触位点中，VAPB分子存在一种一致的扩散模式，这些接触位点共享一个低扩散的中心亚域，其扩散程度向周围区域逐渐升高。结合进一步的分析，研究者认为富含VAPB分子的中心亚域可能代表接触位点粘附力最大的区域。

在对FIB-SEM数据集中的ERMCS进行分析时，研究者发现ER膜在在其中心存在明显的净负曲率区域，与相作用的线粒体形状互补 (图3l)，提示该区域的分子系带使ER膜发生由正曲率到负曲率的高度形变。沿着简单的管状ER结构定位将所有sptPALM检测到的接触位点与管状ER汇入的方向对其，发现由此产生的概率分布与FIB-SEM结果中接触位点内曲率变化区域的模式十分相似 (图3m)。

图3. VAPB分子导致内质网曲率的变化

为了进一步了解ERMCS整体大小的调节机制，研究者在COS7细胞中过表达了VAPB的结合蛋白PTPIP51，并进行sptPALM成像。结果发现在过表达PTPIP51后，接触位点总数并未明显增多，但大小显著增加。在Airyscan成像中，虽然ER和线粒体的整体形态对PTPIP51过表达不敏感，但出现了明显的重排，ER包裹了大多数线粒体 (图4e)。此外，高度过表达VAPB和PTPIP51的细胞基本耗尽了ER池中的VAPB蛋白，导致该蛋白主要在接触位点上定位 (图4g)。

图4. VAPB的结合伴侣PTPIP51的过表达导致ERMCS增大

在此基础上，本文研究者进一步探究了ERMCS在细胞生理和疾病中的变化，发现在细胞饥饿状态下，ERMCS会增大，但仍保持动态性，VAPB分子高度富集在中心亚域，并保留其快速进出接触位点的能力。细胞饥饿状态下的这种动态重塑可以使ER和线粒体进行有效的代谢物质交换，从而促进细胞存活。

而在VAPB基因突变相关的疾病——肌萎缩侧索硬化 (amyotrophic lateral sclerosis, ALS) 中，异常的VAPB更容易聚集。依据前人的研究，这些聚集的VAPB分子可能是非功能性的，并会倍迅速降解，此外，这些异常的VAPB分子也可能导致接触位点动力学和/或功能的异常。通过对P56S VAPB的追踪，研究者发现，许多VAPB分子处于固定状态 (图5b、c, 灰色)，与描述不溶性ER相关聚集体的研究结果相一致。此外，也有相当比例的分子表现出类似于野生型的自由扩散特征 (蓝色)，而另一部分分子则表现出与接触位点相关性更强 (红色)，提示后者可能损害了ERMCS结构和/或动力学。对WT VAPB和P56S VAPB的轨迹进行比较发现，P56S VAPB分子导致ERMCS大小略有增加，且有效扩散减少 (图5d)，P56S VAPB分子在中心亚域内的运动高度受限，相当比例的分子在其整个轨迹寿命中始终停留在ERMCS内。

图5. 在疾病状态下VAPB分子扩散能力的变化

综上，本文研究发现ERMCS具有可塑性，可以依据不同条件对其结构和组织进行调整：如接触位点的大小和形状可以通过结合蛋白的多少进行调节，而在营养匮乏时，接触位点会增大以促进更有效的代谢物转移。此外，本研究还发现，ERMCS中VAPB的动态交换具有相当的重要性，P56S VAPB分子在ERMCS中的存在可能导致接触位点无法进行正常的动态重构，从而影响细胞内信号传导和线粒体功能。这些发现为深入了解ERMCS的作用和细胞间通讯提供了更多信息。

供稿 | 王彤彤

审稿 | 肖媛

责编 | 囡囡

设计 / 排版 | 可洲 王婧曈

微信号：FRCBS-THU

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原文链接

https://www.nature.com/articles/s41586-023-06956-y

参考文献

参考文献

1. Valm, A. M. et al. Applying systems-level spectral imaging and analysis to reveal the organelle interactome. Nature 546, 162–167 (2016).

2. Phillips, M. J. & Voeltz, G. K. Structure and function of ER membrane contact sites with other organelles. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 17, 69–82 (2016).

3. Giamogante, F., Barazzuol, L., Brini, M. & Calì, T. ER–mitochondria contact sites reporters: strengths and weaknesses of the available approaches. Int. J. Mol. Sci. 21, 8157 (2020).

4. Heinrich, L. et al. Whole-cell organelle segmentation in volume electron microscopy. Nature 599, 141–146 (2021).

5. Nishimura, Y., Hayashi, M., Inada, H. & Tanaka, T. Molecular cloning and characterization of mammalian homologues of vesicle-associated membrane protein-associated (VAMP-associated) proteins. Biochem. Biophys. Res. Commun. 254, 21–26 (1999).

6. Murphy, S. E. & Levine, T. P. VAP, a versatile access point for the endoplasmic reticulum: review and analysis of FFAT-like motifs in the VAPome. Biochim. Biophys. Acta 1861, 952–961 (2016).

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