Cell | 首个人类胎儿脑组织来源的大脑类器官

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从干细胞或器官祖细胞发育而来，并能以与体内相似的方式经细胞分序（cell sorting out）和谱系分化（lineage commitment）而实现自组织，这样的细胞类群集合称为类器官。类器官在细胞类型、器官功能、空间组织上具有体内器官的特征¹。近年来，类器官技术发展迅速，目前，已有多种器官成功实现了类器官的培养：包括大脑皮层、肾、肝、胰腺、前列腺、肺、乳腺、输卵管、蛇毒腺等²。类器官主要有两种来源：多能干细胞（pluripotent stem cells, PSCs）与组织干细胞（tissue stem cells, TSCs）。PSC来源类器官通常来源于胚胎干细胞或诱导多能干细胞（iPSC），通过一系列外界信号，指导干细胞沿着特定分化路径从胚状体经过胚层特化最终发育为特定类器官；TSC来源类器官来源于成体或胎儿组织。两种类器官各有优势，互相补充：TSC类器官可以直接在特定的天然人类组织中研究健康或疾病状态下的细胞行为，PSC类器官则适用于研究发育轨迹与相关疾病；TSC类器官可以稳定长期体外扩增，而PSC类器官则往往有特定的分化终点；TSC时常受限于组织来源，而由于多能干细胞的分化具有随机性，PSC类器官间异质性较高³。

各种体内与体外模型是研究人类大脑发育的重要工具，然而现有模型仍存在缺陷。对于动物模型（主要是啮齿类动物），啮齿动物在脑区分层、前脑体积、发育进程、细胞种类上都与人不同4。基于人类细胞的体外大脑模型包括2D培养、神经干细胞来源的神经球（neurosphere）和PSC来源类器官。神经球体积小、组织程度低，通常被认为是细胞的简单聚集（3D aggregates）；PSC来源的脑类器官作为相对地可规模化培养的模型，具有类似组织的3D构造。然而，长期扩增并同时发生细胞分化、建立复杂类组织构造的3D体外脑类器官培养目前仍未实现。

2024年1月8日，荷兰玛西玛公主儿童肿瘤中心的Benedetta Artegiani和Hans Clevers在Cell上发表文章“Human fetal brain self-organizes into long-term expanding organoids”。研究者发现健康胎儿脑组织可以在体外自组织形成类器官 (fetal brain organoids, FeBOs)，FeBOs可在体外长期扩增，并且在细胞异质性与组织复杂度上与体内组织表型相仿。从中枢神经系统不同位置，包括前脑腹侧与背侧来源的FeBOs，可在体外保留相应的区域特征。而CRISPR-Cas9技术展示了构建FeBOs类器官系研究脑部肿瘤的潜能。

从健康胎儿脑组织构建类器官

研究者使用处于神经发育早中期的健康人类胚胎脑组织（12-15孕周），将其切成1-2毫米小块置于无血清、无细胞外基质培养基（包含EGF, FGF-2, FGF-10）培养，4-8天内可形成具有明晰分界的3D结构，并具有类似组织的形态（图1A）。通过切割原有类器官并单独培养，FeBO可以在20-30天内实现稳定传代。从不同捐赠者来源的超过80个FeBOs在类器官生长动力学、形态与大小上均有较好的可重复性（图1C-F）。不同来源FeBOs均可长期扩增，据估计，在8个月传代后FeBOs体积扩增到初始体积的15,000倍，此时，FeBOs生长放缓但仍可维持传代（图1G）。

进一步通过神经发育相关标志物表征FeBOs的细胞组成。神经干细胞/祖细胞往往位于FeBOs边缘，而神经细胞则向中央分布（图1H-J）。此外，星形胶质细胞、外侧放射状胶质细胞（outer radial glial cells, oRGs）也有分布。不同FeBOs间细胞类群的丰度有较高的可重复性（图1L）。慢病毒感染显示标记细胞逐渐由表面向内部神经元富集区域迁移，表明神经发生正在进行（图1M-N）。转录组结果进一步确证FeBOs的神经外胚层特征（图1O）。

图1. 构建人胎儿脑组织类器官

成功建立体外扩增的类器官体系后，研究者进一步探究是否可以培养脑区特异性的FeBOs，并且使其在体外保留内在组织特征。分别从前脑背侧与腹侧组织培养FeBOs（图2A），两种FeBOs形成类器官的效率相仿，可以在体外分别表达背侧与腹侧标志物（图2B-E）。使用免疫荧光对区域特异性进行表征（图2E-G），不同捐赠者来源的背侧或腹侧FeBOs间均表现出相似的细胞类型的分布（图2H）。RNA测序显示背侧与腹侧FeBOs分别聚类，并进一步确证相关标志物的表达（图2I-J）。对长期扩增的FeBOs稳定性进行研究，结果显示不同区域的FeBOs在超过6个月的扩增后仍能保持相关标志物表达与主要细胞类型的比例（图2K）。研究者进一步获得了胎儿脊髓组织类器官与不同皮层来源的类器官，后者中不同株系分别显示不同皮层标志物的富集（图2L）。

图2. 构建不同脑区来源的FeBO

进一步探索控制FeBOs成熟与分化的条件。通过撤去生长因子与添加0.5%的基膜提取物（图3A），FeBOs在此成熟培养基中会放缓生长，转录组显示成熟条件下培养10天的FeBOs基因表达与细胞类型都发生显著变化（图2I，图3B-C），增殖与祖细胞标志物下调，与晚期神经元特化相关标志物表达上调。免疫荧光显示SOX2+ 干细胞减少，泛神经元标志物增加，皮层相关标志物出现并且表现出有组织的排布（图3D-E），腹侧FeBOs中间神经元数量增加（图3G），星形胶质细胞也有增加（图3H）。电穿孔稀疏标记显示许多细胞具有典型的神经元形态（图3I），透射电镜观察到神经末梢处突触小泡以及轴突周围的髓鞘结构（图3J）。此外，不同扩增时长来源的成熟FeBO都表现出自发、规律的钙波（图3K-L）。

图3. FeBOs在分子与细胞层面的成熟

为了进一步表征细胞异质性，对扩增或成熟期的背侧与腹侧FeBOs进行单细胞测序。腹侧FeBOs单细胞测序聚类分析识别13种细胞亚群，包括多种放射状胶质细胞、神经元祖细胞、中间神经元，但小胶质细胞、内皮细胞与其他免疫细胞未检测到（图4A-B）。基于测序结果评估FeBO与组织的相似性，FeBOs与14-25孕周胎儿神经节组织（ganglionic eminence, GE）的pseudobulk分析显示FeBO与14-18孕周的胎儿组织有较好相似性（图4D），gene score分析显示FeBOs细胞亚群富集于对应的组织细胞类型（图4F），UMAP降维显示扩增或成熟期腹侧FeBOs与组织拥有类似的细胞类型（图4G）。背侧FeBOs也表现出与胎儿皮层组织的相似性（图4H-J, M-N）。此外，不同传代时间（2月与6月）的FeBOs在UMAP空间显示相似的分布（图4K），并有很好的相关性（图4L），证明随着扩增细胞种类得以维持。

图4. 单细胞测序揭示FeBOs与胎儿脑组织的细胞相似性

FeBOs形成类似组织的细胞外基质生态位

细胞外基质（extracellular matrix, ECM）以及ECM与细胞间的相互作用在人类大脑发育过程中的扩张密切相关。研究人员推测FeBOs能够维持不断扩张的结构正是由于形成了类似组织的ECM微环境。对ECM相关基因的转录组分析显示扩增期的FeBOs与发育的脑组织有很高的相似性（图5A）；将FeBOs转录组与已发表胎儿脑组织蛋白组数据比较，结果显示ECM相关基因有很好的转录组-蛋白组相关性（图5B）；FeBO培养基上清的分泌组质谱检测到多种ECM组分（图5C）。

进一步探究FeBOs分泌类似组织ECM的能力是否与维持细胞的组织和完整性相关，研究者通过比较完整FeBOs与神经球（FeBOs经过单细胞分散步骤后得到）的分泌组，发现前者ECM成分表达更高；此外，FeBOs切割后ECM成分也有所增加（图5F），证明组织的完整可促进ECM生态位形成，而ECM则促进FeBO以类似组织的方式生长。此外，相比于PSC来源的两种类器官，FeBOs的ECM相关蛋白组与胎儿脑组织最为相似（图5G-J）。

研究者进一步扩展FeBO作为ECM扰动实验平台的应用，并分别测试chondroitinase ABC与4-methylumbelliferone对FeBOs的作用（图5K-O）。

图5. 组织完整性促进FeBOs ECM生态位形成

利用FeBOs评估特定胎儿脑区的形态发生素应答

形态发生素（morphogen）梯度对大脑发育中细胞身份与脑区的建立有关键作用。研究者使用FeBOs研究morphogen对于维持位置身份的作用，以及已建立的位置身份是否具有可塑性。研究者使用BMP与Wnt信号组合（神经管中的背侧发生信号）分别处理背侧、腹侧FeBOs以及两种PSC来源脑类器官（图6A）。7天处理后，只有背侧FeBOs背侧前脑特异性基因表达增加（图6B-D），转录组同样显示不同类器官具有独特的信号应答（图6E-H）。这些结果证明BMP与Wnt信号可以增强背侧FeBOs的皮层命运，但这一信号并不足以逆转背腹命运，显示了前脑背腹身份有限的可塑性。而FeBOs与PSC来源类器官的应答差异主要来源于天然/体外指导下形成的位置身份与细胞可塑性的差异。综上，FeBOs可作为体外模型研究信号分子对体内建立的位置身份的维持与可塑性的影响。

图6. FeBOs展示不同的形态发生素应答

CRISPR编辑的突变FeBOs株用于模拟脑部肿瘤

首先利用CRISPR技术在一小部分细胞中引入TP53敲除突变，在随后的扩增中，突变细胞在类器官中的比例大幅上升，证明了突变细胞的生长优势（图7A-B）。突变类器官中SOX2+细胞比例增多，并形成结节样结构（图7C）；将突变体与野生型FeBOs共培养，突变细胞可迅速侵袭野生型类器官（图7D）。

对于药物筛选，PSC来源的类器官由于个体间差异大、传代能力差而难以应用于大规模药物筛选（图7E-G），而突变FeBOs可通过传代产生大规模等同的类器官株。研究者建立TP53, PTEN, NF1三敲FeBOs以模拟胶质母细胞瘤并进行突变-药物敏感性实验（mutation-drug sensitivity assay）。TPN突变FeBOs可以通过传代形成大小一致、几乎全部由突变细胞组成的类器官株（图7H-J）。Nutlin-3a与trametinib在野生型、TP53单突和TPN三突FeBOs中的药物敏感型均符合预期（图7K-L）。

图7. FeBOs用于肿瘤造模

综上所述，本研究从人类胎儿脑组织中建立可体外长期扩增的类器官FeBOs，FeBOs拥有可靠的分子特征与细胞组成，并能在体外自组织成3D层级结构。与PSC来源类器官不同，FeBOs不会自发分化，而只是来源组织的“分身”，因而可以产生复现性好的类器官株。此外，FeBOs可以从中枢神经系统的各部分培养而来，并在长时间内保持来源组织的特征。值得注意的是，本研究发现保持组织的完整对产生类似于组织的ECM生态位至关重要，进而维持类器官的长期扩增。

图8

供稿 | 许雨茜

审稿 | 肖媛

责编 | 囡囡

设计 / 排版 | 可洲 雨萱

微信号：FRCBS-THU

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原文链接

https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(23)01344-2

参考文献

参考文献

1. Lancaster, M. A., & Knoblich, J. A. (2014). Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science (New York, N.Y.), 345(6194), 1247125.

2. Corrò, C., Novellasdemunt, L., & Li, V. S. W. (2020). A brief history of organoids. American journal of physiology. Cell physiology, 319(1), C151–C165.

3. Hofer, M., & Lutolf, M. P. (2021). Engineering organoids. Nature reviews. Materials, 6(5), 402–420.

4. Zhou, Y., Song, H., & Ming, G. L. (2024). Genetics of human brain development. Nature reviews. Genetics, 25(1), 26–45.

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