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Nature: 跳出单一视角:多构象揭示代谢型谷氨酸受体的活化全景

肖媛 北京生物结构前沿研究中心 2024-05-26

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代谢型谷氨酸受体 (mGlus) 属于一类必需的二聚体G蛋白偶联受体(GPCRs),受到兴奋性神经递质L-谷氨酸的激活。每个亚基包含一个由捕蝇草 (VFT) 结构域组成的大的胞外配体结合域,其中包含正构配体结合位点,以及一个富含半胱氨酸的结构域 (CRD)。CRD将VFT连接到定义这一家族的七次跨膜域 (TMD)1。谷氨酸的结合导致VFT闭合和亚基重排,使CRD和TMD相互靠近2。mGlu的二聚化对其功能是必需的,而受体激活时的重排是一个复杂的异构调节过程,两个亚基相互影响。mGlu的异构调节剂结合TMD,单独或与正构配体一起调节信号传导。最终,激动剂和正向异构调节剂 (PAMs) 通过稳定亚基之间的相互作用来激活mGlu,从而使G蛋白耦合到TMD。


为了更好地理解mGlu的激活机制,揭示配体和G蛋白之间的异构连接,2024年4月17日,美国斯坦福大学Brian K. Kobilka实验室在Nature期刊上发表了题为Stepwise activation of a metabotropic glutamate receptor的论文。本项研究揭示了代谢型谷氨酸受体亚型5 (mGlu5) 在脂质纳米盘中一系列的结构,从非活性到完全活性,包括激动剂结合的中间状态。此外,通过批量和单分子荧光成像,研究者还揭示了在配位调节剂和G蛋白结合时不同的受体构象,提出了mGlu5的多步激活机制模型。



为了全面理解受体激活途径,研究者解析了在小分子正构位激动剂和异构调节剂以及异构纳米体Nb43存在下的mGlu5结构。在正构激动剂L-quisqualic acid (Quis) 和Nb43的存在下,研究者解析了两种受体构象:(1)一种中间态(intermediate 1a,图1a),其中VFT上叶闭合但亚基间距离较大,反映了一种非活跃构象;(2)一种“类活跃”结构(intermediate 2a,图1a),其中VFT下叶、CRD和TMD相互靠近。添加激动剂CDPPB到Quis和Nb43结合的mGlu5中,完全稳定了一个单一的活跃构象(intermediate 3a,图1a),该构象类似于Quis和Nb43结合的intermediate 2a结构。有趣的是,在这个复合物中,研究者观察到CDPPB的不对称作用,仅在两个TMD中的一个上有密度支持其结合,与单独CDPPB但没有Quis或Nb43的mGlu5结构相反,研究者观察到两个TMD都有CDPPB(intermediate 1b,图1a)。研究者进一步使用散射荧光光谱和单分子Förster共振能量转移 (smFRET) 研究了配体和G蛋白结合时的亚基构象变化。研究者观察到与确定的结构相符的受体构象,以及在生物物理学研究中独特观察到的几种受体构象,包括CDPPB稳定的状态(intermediate 2b和3b,图1a)和G蛋白稳定的状态(完全活跃)。最后,结合所有数据,研究者提出了mGlu5分步激活的模型(图1a)


图 1 mGlu5在脂质环境中的逐步激活


为了研究Quis结合带来的变化,研究者将先前确定的Apo结构与当前Quis结合的intermediate 1a结构进行了比较。Quis结合后,VFT上叶和下叶之间的距离减小, 这种减小主要是由于上叶的闭合(图2a)。上叶闭合伴随着下叶和“铰链区”(二聚体界面上叶之间的区域)的一些重排,这些残基运动的阻碍似乎稳定了受体在非活性构象中。此外,研究者还比较了Quis结合的intermediate 1a和intermediate 2a结构,观察到在intermediate 2a结构中VFT下叶发生了大幅度的“扭转”(图2c)。VFT下叶作为一个刚体移动,保持Quis结合口袋,并启动铰链区B和C螺旋的重排(图2b,c)。这些结构变化最终导致CRDs和TMDs彼此靠近(C家族GPCR激活的标志),从而激活mGlus。


图 2 mGlu5在纳米盘中与Quis结合的结构


为了深入了解异构调节剂在受体中的活性,研究者确定了CDPPB结合mGlu5在Quis存在和不存在情况下的纳米盘结构(图3a)。有趣的是,在Quis存在和不存在情况下,研究者分别观察到CDPPB的不对称结合和对称结合。CDPPB与mGlu5 NAM MPEP的相互作用类似3,除了W7856.50(图3b)有一个大的向外运动。在CDPPB结合的亚基中,整个TM6向外移动(图3c)。这似乎导致不含CDBBP的亚基中TM6向内移动,W7856.50阻塞PAM结合位点。这种不对称的PAM结合使原聚体跨膜结构形成紧密的界面,其他研究也表明,W7856.50的构象对稳定活性结构至关重要。


先前的mGlu结构研究表明,在存在G蛋白时,ICL2会稳定下来。为了研究配体结合后ICL2的构象变化,研究者对mGlu5上进行了bimane光谱研究(图3d)。仅仅加入Quis并没有产生显著变化,这表明单独的正构激动剂对ICL的活性构象稳定能力有限。然而,CDPPB加入到Apo或Quis结合的mGlu5中增加了荧光,表明ICL2环境发生了变化。有趣的是,与仅仅Quis相比,Quis和CDPPB结合的mGlu5结构在TM3和TM4上显示了一些变化。这些变化可能潜在地导致ICL2的变化。因此,变构调节剂似乎调节ICL2的构象。


图 3 PAM结合mGlu5的结构变化


VFT的激动剂结合通过CRD触发TM的重新排列。为了研究mGlu5激活的机制,研究者使用smFRET研究了CRD的构象动力学,通过探测CRD之间的距离作为mGlu5激活的标准(图4a)。研究者分别监测了Apo状态、Quis结合状态、Quis和CDPPB共结合状态下mGlu5的FERT峰图(图4b,d)。观察表明CRD是动态的,并且激动剂和PAM的结合逐渐促进了CRD更密切地接触,并且暗示上述解析的中间体结构位于这一动态变化路径上。


此外,为了研究G蛋白对受体构象动力学的影响,研究者将Gq添加到结合Quis的mGlu5中,并分别检测了Apo状态,Quis结合状态、Quis和CDPPB共结合状态下mGlu5-Gq复合物的FERT峰图(图4c,d)。虽然mGlu5-Gq的结构尚未报道,但是根据观察到的smFRET数据显示,至少对于mGlu5来说,在G蛋白存在的情况下存在一个不同的构象。


图 4 mGlu5在纳米盘中被配体稳定的构象


长期以来,C家族GPCR领域的一个研究兴趣是理解从正构位激动剂结合位点到包含异构配体结合口袋和G蛋白结合位点的TMD,如何通过120埃的距离进行异构信号传递。利用cryo-EM和smFRET数据,研究者提出了mGlu5的激活模型,并展示了激动剂、PAM和G蛋白对从非活性到完全活性经过几个中间态的功能状态的影响。由于技术本身的差异,通过cryo-EM和smFRET揭示的构象动态类似但不完全相同。总之,结构和动态数据的综合突出了mGlu5激活的变构性质,揭示了受体激活中的构象多样性及其与G蛋白的相互作用。


供稿 | 肖媛

审核 |谭佳鑫

责编 | 囡囡

设计 / 排版 | 可洲 王婧曈




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原文链接

https://www.nature.com/articles/s41586-024-07327-x

参考文献

参考文献

[1] Pin, J.-P. & Bettler, B. Organization and functions of mGlu and GABAB receptor complexes. Nature 540, 60–68 (2016).


[2] Koehl, A. et al. Structural insights into the activation of metabotropic glutamate receptors. Nature 566, 79–84 (2019).


[3] Christopher, J. A. et al. Structure-based optimization strategies for G protein-coupled receptor (GPCR) allosteric modulators: a case study from analyses of new metabotropic glutamate receptor 5 (mGlu5) X-ray structures. J. Med. Chem. 62, 207–222 (2019).



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