Cell | 设计蛋白低聚物调控血管分化的新方法

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成纤维细胞生长因子（FGF）及其受体（FGFR）在血管生成、细胞分化和组织再生等多种生物学过程中起着关键作用。然而，FGFR的不同亚型在不同细胞类型和组织中的具体功能尚不完全清楚¹，目前商业上可获得的天然信号分子(如FGF2)与小分子通常具有多效性，很难使用这些分子来促进高度特异性细胞亚群的分化并用作相关疾病治疗药物的开发。

6月11日，来自华盛顿大学的David Baker课题组在Cell杂志发表了《Modulation of FGF pathway signaling and vascular differentiation using designed oligomeric assemblies》研究文章。他们展示了一种通过设计新型环状低聚体调控成纤维细胞生长因子（FGF）通路信号和血管分化的新方法。这些人工设计的环状低聚体具有可调的几何特性，能够引发特定的信号传导反应。

研究团队首先通过具有重复螺旋的单体蛋白（DHR）来构建不同几何形态的低聚体。研究人员将这些单体蛋白用不同的方式进行模块化拼接，并根据使用的单体种类与数量的不同形成从四聚体到八聚体的多种低聚体形式，并进行包括改变单体蛋白残基类型和位置在内的多聚体设计优化并进行结构表征，得到更稳定的低聚体设计。这些设计在冷冻电镜（cryo-EM）和SAXS实验中得到了验证，证明它们在几何结构上与设计模型高度一致（图1）。

图1. 低聚体设计的冷冻电镜验证和结构解析

这种由蛋白模块化拼接组成的低聚体的优势在于几何调控灵活，通过简单增加单体或减少单体即可增加或减少低聚体臂的长度（图2）。研究人员选择了DHR71衍生的三个设计（C4-71、C6-71和C8-71），通过在N末端添加两个或四个重复单元，创建了六重复和八重复的变体。这些延伸设计的低聚体在SEC-MALS、SAXS和cryo-EM分析中显示出与设计模型一致的几何形态。

图2. 通过改变单体蛋白的数量改变低聚体臂的长度

研究团队进一步探究利用低聚体聚集受体酪氨酸激酶能否驱动其胞内结构域的交叉磷酸化并诱导下游信号通路的激活，以及不同价态与结构的低聚体对合成纤维细胞生长因子受体（FGFR）的影响是否具有差异。研究人员利用能特异性结合成纤维细胞生长因子受体c亚型（FGFRc）的新型结合模块mb7²连接到低聚体支架的N末端或C末端，形成FGFR激动剂，并测试它们对FGFR相关信号通路的激活能力（图3）。结果表明，有五个低聚体-mb7组合形成的激动剂能强激活FGFR并导致下游ERK蛋白的磷酸化，其中C6-79C_mb7诱导的钙信号持续时间更长，类似添加肝素与FGF2的处理效果。 

图3. 通过设计的激动剂调节FGFR信号通路

研究团队接着利用设计的激动剂探究不同的FGFR异构体（FGFRb、FGFRc）对早期血管发育的调控作用。根据mb7能特异性结合FGFRc并选择性地抑制该异构体的信号传导而FGF2对FGFR的结合不区分异构体类型这个特点，将FGF2与mb7组合即可特异性激活FGFRb。研究人员使用从人诱导多能干细胞（iPSCs）分化得到的细胞，通过流式细胞术鉴定和量化不同处理条件下内皮细胞和围血管细胞的比例。结果显示，FGF2和C6-79C_mb7处理的细胞主要分化为内皮细胞，而mb7+FGF2处理的细胞更多分化为血管周围细胞（图4）。进一步测定的内皮细胞功能指标结果说明C6-79C_mb7在促进内皮细胞分化和功能方面具有显著优势，与FGF2处理相比表现更为优越。

图4. 不同处理条件下内皮细胞和血管周围细胞的分化评估

研究团队在对内皮细胞的亚型进一步比较分析发现，C6-79C_mb7诱导分化形成的内皮细胞中动脉内皮细胞占多数，而FGF2诱导分化形成的内皮细胞中静脉内皮细胞占多数，说明FGFRc相关信号通路的激活会促进动脉内皮细胞的成熟。此外，通过比较C6-79C_mb7和FGF2处理人源诱导多能干细胞形成自组织三维血管类器官（BVOs）的效果发现，C6-79C_mb7处理组形成的BVOs有更明显的动脉特异性标志物表达，并在移植进入小鼠体内可以形成功能性血管结构（图5）。这些结果说明设计的低聚体蛋白有作为亚型特异性激动剂的潜力。

图5. 通过亚型特异性激动剂控制内皮细胞亚型命运

综上所述，这项研究通过创新性地设计环状低聚体，为调控FGF通路信号和血管分化提供了新的工具。这些研究结果也揭示了FGFR异构体在血管发育和细胞命运决定中的关键作用。通过调控不同的FGFR异构体活性，研究人员能够精确控制血管发育过程中细胞的命运。这些低聚体展示了在细胞命运控制和治疗应用方面的巨大潜力，为未来的研究和应用提供了广阔的前景。

供稿 | 吴其乐

责编 | 囡囡

设计 / 排版 | 可洲 王婧曈

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原文链接

https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.05.025

精彩回顾

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参考文献

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1. Turner, N. & Grose, R. Fibroblast growth factor signalling: from development to cancer. Nat Rev Cancer 10, 116–129 (2010).

2. Park, J. S. et al. Isoform-specific inhibition of FGFR signaling achieved by a de-novo-designed mini-protein. Cell Reports 41, 111545 (2022).

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