从头设计的蛋白质能中和致命的蛇毒毒素
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蛇咬伤中毒是一种严重且被忽视的热带疾病，每年导致超过10万人死亡，并使许多人长期残疾。这种中毒主要由眼镜蛇毒素中的三指毒素（3FTx）引起，后者通过阻断神经递质受体导致严重的神经毒性和组织损伤。目前唯一的治疗方法是从免疫动物血浆中提取的多克隆抗体，但这种方法成本高昂，对三指毒素的效果有限。这种情况尤其影响资源匮乏的地区，如撒哈拉以南非洲、南亚、巴布亚新几内亚和拉丁美洲，每年超过两百万人因蛇咬伤而导致10万人死亡，30万人永久性残疾。尽管世卫组织将其列为最高优先级的被忽视热带疾病之一，但用于改善治疗方法的资源仍然非常有限。
鉴于目前的挑战，David Baker组提出了一个从头设计蛋白质来中和蛇毒毒素的方法，题为“De novo designed proteins neutralize lethal snake venom toxins”。其利用深度学习方法，设计出了能够结合眼镜蛇毒素中的短链和长链α-神经毒素及细胞毒素的蛋白质。通过有限的实验筛选，研究团队成功获得了这些设计的蛋白质，其具有显著的热稳定性和高结合亲和力，并且与计算模型接近原子水平一致。这些设计的蛋白质在体外能够有效中和眼镜蛇毒液中的所有三种3FTx亚家族毒素，并保护小鼠免受致命神经毒素的攻击。
α-神经毒素结合蛋白的设计
α-神经毒素是三指毒素（3FTxs）的一个子类（图1a），由多股β-结构和三个延伸环组成，稳定性由二硫键桥保障。短链和长链α-神经毒素在长度和二硫键数量上有所不同。它们抑制不同的烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）亚型，短链和长链均抑制肌肉型nAChRs，但只有长链能结合神经元α7 nAChRs。由于这些毒素是眼镜蛇毒液的主要成分，中和这两种α-神经毒素对治疗效果至关重要。
作者利用RFdiffusion模型设计了针对神经毒素边缘β链的结合剂，旨在通过空间位阻阻断神经毒素与nAChR的结合。生成主链后，使用 ProteinMPNN进行序列设计，并选择最有希望的候选者进行实验验证。
图1. 3指蛇毒素(3FTxs)
针对短链α-神经毒素，使用共识毒素（ScNtx）作为模板。通过酵母表面展示（YSD）筛选44个设计，确认一个候选者与ScNtx结合。经过优化后，ScNtx结合蛋白（SHRT）的亲和力提高到0.9 nM。X射线晶体学显示其结构与计算模型高度一致（2.58 Å分辨率；1.04 Å RMSD）。
针对长链α-神经毒素，选择Naja kaouthia中的α-眼镜蛇毒素作为模板。筛选42个设计后，一种候选毒素的结合亲和力为1.3 μM。经过优化后，亲和力最高的结合剂（LNG）的Kd为1.9 nM。X射线晶体学显示其结构与设计模型吻合（2.68 Å分辨率；设计RMSD为0.42 Å，毒素RMSD为0.61 Å）。
图2. 3FTx结合蛋白的实验表征
细胞毒素结合蛋白设计
细胞毒素是眼镜蛇毒液中三指毒素（3FTx）家族的重要功能组（图1b），通过破坏磷脂膜产生细胞毒性效应，导致局部组织损伤。中和这些毒素对于防止严重后遗症至关重要。
为了中和细胞毒素，作者设计了能直接结合细胞毒素三指环的蛋白质，利用RFdiffusion生成蛋白质骨架，并在关键区域定义热点残基。针对86种不同蛇的细胞毒素（IA型细胞毒素亚家族）共识序列进行设计，并使用 ProteinMPNN 和 AF2 进行筛选，进一步优化具有最佳指标的设计。最终筛选出55种蛋白质设计并测试了18种单体群体。
其中，CYTX蛋白质结合剂表现出高溶解度、单一单体峰，并对Naja pallida和Naja nigricollis毒液具有高中和活性。SPR测试显示Naja pallida细胞毒素的Kd为271 nM，CYTX具有良好的热稳定性。
为了结晶CYTX与Naja pallida细胞毒素的复合物，作者引入了一个二硫键，产生了热稳定性更好的CYTX_B10，但Kd为740 nM。CYTX_B10的结构与计算模型高度一致（分辨率：2.0 Å；RMSD：设计1.32 Å，毒素0.58 Å），展示了细胞毒素环II和III与CYTX_B10之间的静电相互作用。
图3. 3FTx结合蛋白的晶体结构与设计模型非常吻合
评估结果
体外中和
研究团队在膜片钳实验中评估了设计蛋白中和α-神经毒素的能力，使用了表达肌肉型nAChR的细胞系。结果显示，SHRT设计在1:1摩尔比下实现了完全中和，优于现有的ScNtx纳米抗体。LNG设计在相同摩尔比下对α-眼镜蛇毒素也实现了完全保护。团队还在细胞毒性试验中评估了CYTX设计对七种Naja物种毒液的交叉反应性，结果显示在1:5摩尔比下，CYTX提供了70-90%的保护。同样，将CYTX与N. pallida细胞毒素预孵育，在1:5摩尔比下提供了85%的保护。然而，在小鼠模型中，CYTX设计未显著减少N. nigricollis毒液引起的皮肤坏死，表明其亲和力需要进一步优化以实现体内完全中和。
图4. 设计的蛋白抗蛇毒毒素的体内外药效研究
体内保护
研究团队在体外实验中取得积极结果后，进行了体内研究。通过腹膜内注射，确定了雄性非瑞士白化病小鼠的α-神经毒素平均致死剂量（LD50），其中α-眼镜蛇毒素的LD50为0.098 μg/g，ScNtx的LD50为0.087 μg/g。评估神经毒素结合剂的中和能力时，SHRT在1:10摩尔比下与短链神经毒素预孵育并注射，小鼠存活率达100%；LNG结合剂在相同条件下完全中和了α-眼镜蛇毒素。在模拟救援试验中，注射致命剂量后15分钟施用结合剂，小鼠存活率达100%。毒素注射后30分钟施用SHRT提供100%保护，而LNG提供60%保护。所有幸存小鼠无肢体或呼吸麻痹。
总结
传统抗蛇毒血清存在多种限制，包括对低免疫原性毒素效力有限、易导致严重不良反应、批次间差异及高生产成本。本研究设计的新型结合剂可作为抗蛇毒血清的增强剂，特别对眼镜蛇毒素效应显著，通过中和多种毒素加速疗效。计算机辅助设计降低了开发成本，有助于全球范围内有效治疗蛇咬中毒及其他热带病。这种有效、稳定且易于制造的中和毒素蛋白，为下一代抗蛇毒血清疗法提供了基础，使疗法更安全、成本效益更高且更广泛可及。此外，研究方法的应用也有助于在资源有限的环境中推动治疗方法的发展，降低了开发忽视热带疾病治疗的成本和资源需求。
供稿 | 徐艺然
责编 | 囡囡
设计 / 排版 | 可洲 王婧曈
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原文链接
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC11118692/
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