Nature | ET+EM揭示突触素蛋白调控突触囊泡生成与功能的分子机制
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突触囊泡是一种平均直径约40纳米的亚细胞器，由特定的蛋白质和脂质组成，它们负责存储并适时释放神经递质，这一过程对于介导神经元之间的信息传递至关重要。虽然已经对突触囊泡的一些生化与形态学特征有了初步的认识，但是对于构成突触囊泡的多种关键蛋白如何协同工作，以确保神经递质的有效存储和适时释放，仍然知之甚少。
2024年6月5日，斯坦福大学Axel T. Brunger课题组和北京大学郭强课题组课题组在Nature发表了题为“Structure and topography of the synaptic V-ATPase–synaptophysin complex”的研究论文。该研究首次发现了神经突触囊泡上的氢离子泵V-ATPase与突触素蛋白Synaptophysin之间的相互作用，并深入探讨了其对突触囊泡生成和功能的影响。
V-ATPases（Vacuolar H+-ATPases）是一个高度保守的ATP依赖性质子泵家族，其建立的质子梯度对于实现细胞器特异性功能至关重要，包括膜运输、内吞作用、溶酶体降解和神经递质释放。突触囊泡膜上的V-ATPases通过消耗ATP将质子泵入突触囊泡内部，从而建立和维持酸性环境。这个酸性环境对于神经递质的包装和储存至关重要，因为许多神经递质需要在酸性条件下才能有效地积累在突触囊泡内。除了作为突触囊泡上的质子泵的作用外，突触V-ATPases也参与调节神经元胞吐过程，尽管它不直接参与膜融合。
突触素（Synaptophysin）是神经突触囊泡表面最为丰富的蛋白之一，在神经科学领域中经常被用作突触囊泡的标志性蛋白。尽管它在突触囊泡中的丰度很高，但其确切的生物学功能至今尚未完全阐明。然而，该蛋白的功能研究存在一定困难，Synaptophysin的缺失并不总是导致明显的表型效应，因为其他同源蛋白（如synaptoporin和synaptogyrin）可以上调并部分补偿突触素的功能。由于存在这样的补偿机制，使得研究突触素本身的功能变得更加困难。
该研究团队了原位冷冻电子断层扫描和单颗粒三维重构技术，对小鼠大脑中分离的谷氨酸能突触囊泡进行了表征。在ISVs的冷冻电子断层扫描重建中，研究者发现了“完整”（即包含V0和V1两个部分）以及仅含V0域的V-ATPase组装体（图1），这表明在功能性的ISVs中同时存在完整的和仅含V0域的V-ATPase组装体。
图1.突触囊泡的纯化以及突触囊泡冷冻电子断层数据
有趣的是，无论是完整的还是仅含V0域的V-ATPase图像都显示了一个额外的密度区域，足以容纳一个大约20 kDa的蛋白质（图2），而这一额外的密度区域在任何重组纯化的V-ATPase结构中均未被观察到，这表明额外的密度区域至少包含一个仅存在于突触囊泡膜的特定结合伴侣。
图2.橙色标注了观察到的额外密度
随后，通过冷冻电镜单颗粒技术以及交联质谱等技术，确定了功能性谷氨酸能小鼠ISVs突触囊泡V-ATPase复合体的结构，并鉴定了额外密度可能是突触素蛋白Synaptophysin（图3）。为了进一步区分该密度是Synaptophysin还是其同源物，研究者构建了Synaptophysin基因敲除小鼠（syn-/-），提取了syn-/-小鼠的突触囊泡，对其进行了结构比较。发现syn-/-小鼠突触囊泡上V-ATPase中对应位置的部分电子密度的缺失，证实了该蛋白为Synaptophysin，由此，突触囊泡膜上的V-ATPase与Synaptophysin形成1：1化学计量比的稳定复合物被鉴定。
图3. V-ATPase-synaptophysin复合物的验证
比较WT和syn-/-两个结构发现，V-ATPase与突触素相互作用后构象变化不大，但在Synaptophysin基因敲除后，V-ATPase的平均拷贝数显著增加（图4）。而过多的V-ATPase拷贝数可能会增加突触小泡对氢离子的通透性，进而影响神经递质的装载，导致突触小泡功能的异常。为了证实这一模型，研究团队发现syn-/-小鼠表现出重度癫痫易感性，这提示突触素Synaptophysin缺失可能会影响神经递质释放。
图4. Syp−/−小鼠V-ATPase拷贝数增加和癫痫易感
总结来说，该研究通过原位冷冻电子断层扫描和单颗粒三维重构技术，对从小鼠大脑中分离的功能性突触囊泡，首次发现了突触囊泡V-ATPase和synaptophysin的复合体。而这种相互作用在重组表达的V-ATPaseATP的结构研究中没有被观察到，凸显了在原位的天然膜环境中研究蛋白质结构和功能的重要性，同时也说明了结合cryo-EM和cryo-ET等方法进行原位结构解析的巨大应用潜力。
参考文献
参考文献
Wang C, Jiang W, Leitz J, et al. Structure and topography of the synaptic V-ATPase-synaptophysin complex. Nature. 2024;631(8022):899-904. doi:10.1038/s41586-024-07610-x
原文链接
供稿 | 李佳晨
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