Nature | 巧合的完美修复—propofol恢复HCN1通道癫痫突变体的电压依赖性门控
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节律性循环，比如兴奋细胞中的自发和重复的放电过程，是调节各种生物过程的重要时间机制。其中，起搏电流最初是在心脏中描述的，后来也在神经中被特征化1，后来，研究者们发现这种电流是通过超极化激活的环核苷酸门控 (HCN) 离子通道介导的2。
HCN通道属于电压门控K+ (Kv) 通道的超级家族。与多数Kv通道类似，HCN通道也由四个亚单位组成。每个亚单位包含六个跨膜片段（S1至S6），其中S1到S4形成电压传感域（VSD），而S5到S6形成孔域。然而，大多数Kv通道是在去极化时激活的，而HCN通道则是在超极化时激活，背后的机制仍不完全清楚3。
此外，HCN通道对于心脏和神经的起搏活动至关重要，考虑到它们的多重作用，HCN通道的功能障碍与多种疾病有关，包括心律失常、癫痫和神经病理性疼痛等，使HCN通道成为新的治疗探索的有吸引力的靶点。其中，早期婴儿癫痫脑病 (EIEE) 影响小儿群体，可能由HCN1功能增强引起，包括位于孔域的S5和S6螺旋中的M305L和D401H突变4。尽管到目前为止仅发现少数EIEE病例，但有限的基因分型结合近期的技术进步和研究使其得以发现，表明这种多态性在群体中的真实发生率可能更高。因此，抑制HCN1的药物可能是治疗EIEE以及神经病理性疼痛的有前景的候选药物。
2024年7月31日，美国康奈尔医学院Crina M. Nimigean实验室与迈阿密大学H. Peter Larsson实验室合作，在Nature期刊上发表了题为Propofol rescues voltage-dependent gating of HCN1 channel epilepsy mutants的论文。研究者解析了丙泊酚结合HCN1通道的冷冻电镜结构，发现丙泊酚可以恢复两种与癫痫相关的HCN1多态性造成的电压依赖性闭合，并提出了一种电压依赖性门控模型，其中丙泊酚稳定了HCN通道中电压传感器与孔道之间的耦合，尤其是在这个保守的甲硫氨酸-苯丙氨酸界面。这些发现为设计针对HCN通道病的特定药物提供了新的可能性。
研究者解析了HCN1组装到nanodisc里的Apo结构以及结合propofol的复合物结构，均为闭合状态（图1）。有趣的是，研究者发现HCN1的四个亚基都能分别结合两个propofol分子，其中，第一个propofol结合位点位于四聚体的小口袋内，由相邻亚基的S5和S6螺旋形成，可以想象，propofol在位点1的结合会形成空间位阻，防止S6螺旋相对于S5的运动，而这种运动对于细胞内通道的开放是必要的。此外，位点2则位于亚基内，在S2跨膜螺旋的细胞内侧。propofol在这里可以与脂质双分子层中的脂质相互作用，同时还与HCN1通道中的一个疏水性区域相互作用。
图 1 HCN1 Apo结构和结合propofol的复合物结构
研究者进一步比较了HCN1闭合结构、HCN1交联结构以及HCN4开放结构，发现在闭合构象下，HCN通道内存在一个疏水口袋，刚好可以容纳一个propofol分子；而在交联或开放状态下，这个疏水口袋被表面遮挡（图2）。因此，propofol结合到这个口袋会抑制与S5和S6向外旋转从而锁定了HCN1的闭合构象。相比之下，位点2是状态独立的，在闭合、激活或开放的HCN结构之间没有显著的构象变化。为了进一步探究位点1是否负责propofol诱导的通道抑制，研究者进行了一系列的突变实验。实验结果表明，位点2是一个非抑制性的丙泊酚结合位点，而位点1则是HCN1中的抑制位点。
图 2 位点1是一个状态依赖型口袋，突变相关残基会降低其药物靶向性
HCN1 M305L是一种与癫痫病理相关的突变，位于位点1（图3）。与之前的电生理学一致，Met305突变会导致HCN1通道不受电压控制。但是令人出乎意料的是，加入30µM的propofol使电压依赖性门控得以恢复，并且在生理范围内出现了去极化诱导的通道关闭。Propofol对HCN1 M305L突变体的显著影响不仅支持了位点1是propofol结合发挥作用的假设，还表明，在这个位点上propofol的抑制不仅仅是通过对开放构象产生空间位阻，还影响了电压依赖性的关闭。接下来，研究者还研究了另外两个突变，HCN1 D401N和D401H（致病突变）。与HCN1 M305L类似，propofol同样恢复了HCN1 D401N和D401H的超极化电压依赖性门控（图3e,f）。
鉴于M305L突变体的显著表型，研究者对其进行了结构研究。研究者解析了HCN1 M305L在有无propofol存在下的nanodisc结构（图3g），与WT一样均为闭合构象。重要的是，突变体电压传感器区域与WT通道完全相同，强烈表明其电压感应能力完好。结合propofol的M305L结构在位点1中含有propofol密度，尽管其方向与WT结构中观察到的不同。然而，在位点2未观察到丙泊酚样的密度，进一步支持位点2是一个非抑制性位点的假设。
图 3 丙泊酚恢复了致病性HCN1突变体的功能
为了深入了解propofol如何修复通道，研究者进一步探究HCN通道致病突变中“漏电”表型的机制。HCN1 M305L在脂质环境下的结构显示电压传感器域完整，这表明漏电表型是由于耦合丧失造成的。研究者通过spHCN和电压钳荧光测量 (VCF) 来监测S4电压传感器在膜电压变化时的运动，研究了在非洲爪蟾卵母细胞中表达的spHCN通道中，M375L（与HCN1中的M305L同源）的电压传感器运动和通道的开启（图4a）。
与HCN1中的M305L突变体类似，spHCN M375L突变通道在负电压和正电压下都显示出较大的自发电流（图4b）。spHCN WT通道在超极化时导电性增加，而spHCN M375L通道在所有电压下（从40 mV到-160 mV）显示出相似的导电性（图4c）。这表明M375L使得spHCN通道对电压不再敏感，这与哺乳动物同源突变M305L的结果一致。
图 4 与癫痫相关的同源M305L突变通道电压不敏感，但电压传感器的运动是完整的
此外，研究者还发现在通道闭合状态下与Met375接触的残基Phe459对HCN通道的电压依赖性关闭至关重要。研究者构建了双突变体M375F-F459M，两个单突变体M375F和F459M在spHCN通道关闭的正电压下都表现出较大的自发电流。然而，交换突变体M375F-F459M的电压依赖性更接近野生型通道，其自发电流也比两个单突变体都要小，这表明硫-芳香族相互作用得到了恢复，并且对通道在正电压下关闭是重要的（图5）。由于这两个残基在HCN家族中高度保守，这表明Met与Phe之间的相互作用对HCN通道的闭合状态非常重要。
图 5 Met375和Phe459之间的相互作用对正电压下关闭spHCN通道非常重要
最后，为了排除propofol对电压传感器本身的影响，研究者进行了VCF实验，结果发现尽管10µMpropofol降低了spHCN野生型通道的电流，但并没有导致荧光信号的变化。FV未被丙泊酚改变，这表明propofol在不改变野生型通道S4电压传感器运动的情况下抑制了HCN电流（图6）。结合结构数据，这些结果表明propofol结合在S5和S6之间的凹槽中，并在不改变通道S4电压传感器运动的前提下抑制了HCN电流。
图 6 Propofol抑制spHCN电流，但不改变电压传感器的运动
综上所述，研究者开创性地发现，propofol通过结合在电压门控关键区域中的一个电压依赖型口袋来抑制HCN通道。发现显示，那些电压敏感性弱或没有电压敏感性的HCN1通道致病突变可以通过propofol修复，这表明propofol会以别构方式增强电压门控的耦合，从而有利于通道的关闭。此外，研究还表明，跨膜的甲硫氨酸-苯丙氨酸相互作用是HCN通道中电压传感器和孔道之间非典型耦合所必需的，而且这一作用被propofol增强。propofol对HCN通道的特殊机制可以被独特地用于开发针对神经痛和癫痫的新型精准药物。
图 7 propofol对野生型HCN1和M305L致病突变的作用机制
原文链接
https://www.nature.com/articles/s41586-024-07743-z
参考文献
参考文献
[1] Brown H.F. DiFrancesco D. Noble S.J. How does adrenaline accelerate the heart? Nature. 1979; 280: 235-236
[2] Gauss R. Seifert R. Kaupp U.B. Molecular identification of a hyperpolarization-activated channel in sea urchin sperm. Nature. 1998; 393: 583-587
[3] Lee, C. H. & MacKinnon, R. Voltage sensor movements during hyperpolarization in the HCN channel. Cell. 2019; 1582–1589 e1587
[4] Bleakley, L. E. et al. Cation leak underlies neuronal excitability in an HCN1 developmental and epileptic encephalopathy. Brain. 2021; 2060–2073
供稿 | 肖媛
审稿 | 谭佳鑫
责编 | 囡囡
设计 / 排版 | 可洲
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