Nature | 新冠病毒重塑宿主膜系统的结构基础
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新冠病毒作为冠状病毒界的关键研究对象一直被领域内研究者高度重视，它属于RNA病毒，在RNA复制过程中，正链RNA病毒会重塑细胞内膜系统，例如小RNA病毒、黄病毒、诺如病毒和冠状病毒。而冠状病毒（包括MERS-CoV，SARS-CoV-2，MHV）的复制会导致宿主细胞形成双膜囊泡（DMV），便于后续病毒RNA的合成和修饰。
近来科研人员利用原位冷冻电子断层扫描技术（cryo-ET），在MHV和SARS-CoV-2感染细胞的双膜囊泡上发现了一种孔复合物。经验证，nsp3和nsp4是构成孔复合物的最小组成单位，受限于较低的原位分辨率，DMV孔复合物的分子结构以及nsp3-nsp4在孔形成过程中的机制作用仍不清楚。
为解决这一问题，2024年8月14日，来自香港大学李嘉诚医学院的倪涛和袁硕峰课题组在《自然》杂志联合发表文章“Molecular architecture of coronavirus double-membrane vesicle pore complex”。该研究利用nsp3和nsp4体外组装成DMV，借助cryo-ET技术成功解析了SARS-CoV-2 nsp3–nsp4孔复合物的分子结构，整体分辨率为4.2Å。
图1 冠状病毒 DMV nsp3–nsp4孔复合物的整体结构
研究人员在HEK293F细胞中表达了SARS-CoV-2 nsp3–nsp4连接多肽，该多肽通过nsp3中的类胱蛋白酶（PLpro）被切割为nsp3和nsp4，形成的DMV通过链霉亲和色谱进行纯化，同时利用Western Blot和质谱确认DMV中存在nsp3和nsp4。利用冷冻电镜和一系列分辨率优化措施，nsp3–nsp4孔复合物总体分辨率达到4.2 Å，局部分辨率从中心的3.9Å到边缘区域的7.1Å。完整的nsp3–nsp4孔复合物由12个nsp3和12个nsp4分子组成（nsp3L/nsp3S/nsp4L/nsp4S=6:6:6:6），整体呈六重对称。
图2 孔复合物中nsp3和nsp4的拓扑结构以及结构域排列
研究人员将DMV全孔复合物从上到下分为三个主要部分：爪部、上底座和下底座。nsp3位于上膜中，构成爪部和上底座，而nsp4则位于膜交界处和下膜中，形成下底座。
nsp3结构域大多位于孔的细胞质侧，构成DMV细胞质环。nsp3的N端Ubl1-Mac1在完整孔中不可见，表明它们在孔组装过程中是非必需的，而nsp3L其余的N端区域构成了完整孔复合物的爪部。爪部与上底座之间的相互作用则主要来自于PLpro和CoV-Y形成的界面，爪部内的相互作用似乎由DPUP与PLpro C端的界面稳定。为适应与CoV-Y基座的相互作用，Ubl2-PLpro在nsp3–nsp4孔复合物中呈现约45°的弯曲。nsp3的C端结构域能够形成两个同心的六聚体层，构成细胞质侧爪部下方的上底座，并通过它们的TMD锚定于膜上，该TMD由四个跨膜螺旋（TM1–4）和一个短的水平螺旋组成。其中nsp3-TM1被外部结构域（nsp3-ecto）的N端穿过，远离中央孔。nsp3的TM2–4负责支撑中央孔复合物：TM3和水平螺旋是埋藏在磷脂双层中的短螺旋，而TM2和TM4分别与外部结构域和细胞质Y1域相连接。TMD、Y1以及CoV-Y域（nsp3C）在Nidovirales目中的病毒中是保守的，而nsp3的N端区域则变化很大。
nsp4包含六个跨膜螺旋，其外部结构域（nsp4-ecto）位于膜间隙中，CTD则位于DMV腔内，形成两层同心堆叠的六聚体，构成孔复合物的下底座。中心相互连接的nsp4六聚体（nsp4L）内的分子相互作用主要由两个分子间的反平行跨膜螺旋（TM2和TM3）介导，形成膜交界处的中央孔。另一个nsp4六聚体（nsp4S）位于孔的底部边缘，而其外部结构域仍与其他六聚体的外部结构域在同一水平位置。两个nsp4分子采用不同的构象以适应孔复合物中的局部环境：nsp4-TMD的排列显示nsp4-ecto旋转约120°，主要由nsp4L中TM2和TM3的分离介导，这与nsp4S中连续的长弯曲TM2–3螺旋形成鲜明对比。nsp4-CTD展现出三聚体的二聚化构象，而非六重对称的六聚体。nsp4-CTD三聚体与猫冠状病毒（FCoV）nsp4的晶体结构相似，尽管FCoV-nsp4似乎是扭曲的五聚体（不完整六聚体），而不是平坦的二聚构象的三聚体。总体而言，研究人员解析了nsp3和nsp4在这一独特孔复合物中的拓扑结构和域组织。
总结来说，研究人员解析了以nsp3-nsp4为最小组成元件的DMV孔复合物结构，并且该复合物可能通过中心带正电荷的精氨酸环协调来行使RNA易位的功能，这为理解DMV孔的形成和RNA的易位建立了一个新的框架，为开发新的抗病毒策略以对抗冠状病毒感染提供了结构基础。
原文链接
https://www.nature.com/articles/s41586-024-07817-y
供稿 | 黄隽豪
责编 | 囡囡
设计 / 排版 | 可洲
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