揭示黏着斑的秘密：Talin蛋白如何通过液液相分离在膜上形成“微型工厂”

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粘着斑（Focal adhesions）围绕激活的整合素受体在质膜上形成液体状组装体。它们如何实现其柔性特性尚不清楚。本文作者利用重组粘着斑蛋白在体外重建核心结构，他们发现核心粘着斑蛋白talin和vinculin在一系列条件和互作物的参与下发生液液相分离（liquid-liquid phase separation, LLPS）。膜结合的talin与含PIP₂的膜之间的表面相互作用导致talin被激活，进而引起二维talin凝聚物的形成。这种PIP₂介导的talin聚集增强了talin与细胞膜的连接。作者提出，细胞质中的可溶性蛋白质在膜上组装形成二维生物大分子凝聚物：脂质结合触发蛋白质活化，进而触发这些膜结合蛋白的液液相分离。这可以解释早期粘着斑既能在细胞质中保持结构化的抗力组织，又仍具有高度动态性并能够快速组装和分解。

背景

局部黏着斑将肌动蛋白细胞骨架与细胞外基质连接，从而调节细胞形状、迁移、分化和对细胞外刺激的反应ⁱ。黏着斑被细胞膜上激活的整合素受体围绕，是一种由密集排列的蛋白组成的高度动态性组合体。这些复合物可以响应细胞信号迅速形成和分解，或者在细胞外基质和细胞肌动球蛋白网络之间形成稳定持久的连接。黏着斑蛋白主要通过弱的多价相互作用反应，并能在黏着斑和细胞质之间快速交换。单个黏着斑连随着时间的推移而生长和成熟，并可相互融合。已有数学模型得出结论，快速、动态地组装局部黏着斑所需的蛋白质浓度远远超过细胞膜和细胞质中的平均浓度，并且需要额外的组织水平来导致蛋白质的局部富集。有趣的是，以上所述的黏着斑定义特征也适用于液液相分离介导的生物大分子凝聚物。因此，将黏着斑表征为相分离的分子组装可能是理解其形成、动力学和作为细胞机械感知信号中枢作用的关键。

talin是一种大的(272 kDa)机械敏感的结构支架蛋白(图1a)，是调节整合素聚集和膜上蛋白质组织的理想候选蛋白。talin将整合素受体连接到肌动蛋白细胞骨架上，对于黏着斑的形成至关重要。talin长约100 nm，在局部粘附具有高度极化取向：其n端定位于膜上的整合素受体（integrin receptor），而c端定位于应力纤维附着的位置。talin横跨整个黏着斑复合物，是其纳米级组织的主要决定因素。然而，作为一种细胞质蛋白，细胞质中典型的talin相分离并不能解释膜上高度有序的层状黏附结构。通过LLPS形成的三维凝聚物是无定形的、各向异性的结构，而膜蛋白则有内在的取向。以膜为结构平台，黏着斑及其信号复合物在膜上组装，这些凝聚物具有固有的各向异性和极性，将生物分子凝聚物的特性和膜结合talin的极性结合在一起，在此功能场景下，可以解释黏着斑是如何形成由数百种蛋白质组成的高度有组织的动态中心。

作者首先表征了重组全长talin和重组vinculin之间的相互作用(图1a)。Vinculin直接与talin和actin相互作用，并被招募到生长的黏着斑中来调节机械转导。talin和vinculin都需要从它们的自抑制构象中被释放才能相互作用(图1b)。为了观察talin 的激活，作者通过破坏vinculin头部和vinculin尾部结构域之间的两种自抑制相互作用，设计了一种去调控的vinculin (Vn^DR)。实验发现，混合后，全长talin和去调控的vinculin可以形成液液相分离的液滴(图1c)。脊椎动物有两个talin基因，Tn1和Tn2，虽然在功能上没有冗余，但它们有76%的相似性。作者使用甲基纤维素作为拥挤剂来模拟细胞质中的条件，将Tn1和Tn2分别与Vn^DR混合，观察到Tn2形成微米大小的液滴，而Tn1形成更小的液滴。观察到的talin1和talin2相分离阈值的不同可能是由于分子内相互作用强度的微小差异，从而调节了自抑制蛋白的三级结构。通过观察多个液滴的融合以及测量光漂白后的荧光恢复(FRAP)，作者证实了talin-vinculin液滴的液体性质(图1d、e)。Tn2-Vn液滴的恢复速度随着时间的推移而下降，这表明这些冷凝物随着时间的推移变得更粘稠。Vn^DR-A501是一种不能与talin结合的vinculin突变体，Tn2无法与野生型Vn或Vn^DR-A501相分离(图1f)，这表明相分离需要特异性的talin-vinculin相互作用。talin二聚化结构域也是液滴形成所必需的，点突变Tn2^E1772A减少了talin头部和杆状结构域之间相互作用，使得富含蛋白质的相的体积增加，这表明talin自抑制降低了其相分离的倾向(图1g)。

图1 Talin经历液-液相分离

整合素受体是黏着斑的基础，将细胞内的机械敏感和信号机器与细胞外环境中的配体连接起来。整合素由非共价异二聚体组成，称为α-和β-亚基，当与细胞外配体结合时，它们在弯曲的无活性构象和延伸接合的活性构象之间转换。β-整合素的胞质结构域通过F3结构域上两种不同的互作位点直接与talin头部结构域结合。这种相互作用对于整合素的激活和信号传导至关重要，因为talin结合会引发构象变化，使得α-和β-亚基分离，从而增加整合素对细胞外配体的亲和力。为了检验整合素结合是否能促进talin的相分离，作者合成了整合素细胞质尾部序列β1D的荧光标记肽(图2a)。作者观察到，在拥挤的条件下，无须添加额外的激活结合伴侣（如Vn^DR） Tn2与β1D肽也能单独形成液体状液滴；当Tn1和β1D混合时，没有观察到相分离；Tn2^S339L的突变导致talin2对β1D结构域亲和力增加，大大减少了富蛋白相的体积，这证实了液滴的形成是talin2 -整合素特异性相互作用的结果(图2b)。在这些液滴中，与Tn2- Vn^DR液滴相比，光漂白后Tn2的恢复率降低，而β1D的恢复率很快(图2c)，这表明基于Tn2的液滴内部的动力学可以根据结合伴侣的不同而变化。最后，野生型Vn被招募到Tn2-β1D液滴中，这表明Tn2处于开放构象。在野生型Vn存在的情况下，富含蛋白的相总体积减少，这可能表明vinculin限制talin诱导的整合素聚集的调节作用(图2d)。综上所述，这些结果表明，无论是Vn^DR还是β1D对Tn的激活都足以促进talin相分离。

图2 整合素β1D驱动talin的相分离

虽然上述实验表明，激活的vinculin和β1整合素都可以解除talin的自抑制作用，但它们不太可能是黏着斑起始和组装过程中主要的talin激活剂。磷酸肌肽PIP₂在调节talin在质膜的定位和激活中起主要作用，并且PIP₂对于正常形成功能性黏着斑是必需的。talin头部的F2F3结构域对PIP₂有强烈的偏好性，此外，可能需要细胞膜相互作用来触发导致整合素激活的构象变化。因此作者接下来验证，含有PIP₂的膜是否也可以通过解除talin的自抑制来触发相分离。作者引入脂质进行了体外蛋白溶液的相分离实验(图3a)。将直径<100 nm相对均匀的小单层囊泡分散体(SUV) 在生理条件下与Tn2混合，观察到Tn2与具有PIP₂的SUV结合时相分离，但与缺乏PIP2的SUV混合时没有发生相分离(图3b)。通过加入β1D肽或Vn^DR可以增强Tn2的相分离。当与20% PIP₂ SUV混合时，Tn1不形成液滴(图3c)，这和Tn1对PIP₂的亲和力较低的现象一致。

接着作者将Tn2添加到含有5% PIP₂的液体支撑脂质双层(SLBs)中，观察到单独的Tn2不足以在含有双层的PIP₂上形成簇，而当与野生型Vn一起添加时，在五分钟内迅速形成微米和亚微米尺寸的二维(2D)圆形Tn团簇 (图3d)，光漂后能部分恢复(图3e)。团簇随着时间的推移而增长，出现边界波动(图3f)。这些观察结果表明，虽然膜上团簇的流动性可能不如3D液滴，但它们不是静态结构。另外β1D肽被强烈招募到团簇中，比在添加了拥挤剂的溶液中所需的talin-to-peptide比例要低得多(图3g)。

图3 膜结合的talin相分离

图4阐释了由talin和vinculin形成二维生物分子凝聚物的机制。talin结合并被膜上的PIP₂激活，触发talin二聚化和野生型vinculin的募集。一旦与talin结合，vinculin也形成二聚体，从而招募额外的膜结合talin分子，并导致多价相互作用的网络的形成，包括膜结合的talin-vinculin凝聚物，以及在双分子层中作为其底部基础的富含PIP₂的膜结构域。

图4 含PIP₂的SLB上Talin相分离的机理

为了阐明talin和膜之间的相互作用，作者开发了一种使用光镊测量单个Tn2-PIP₂相互作用强度的方法(图5a)。为了测试当通过FERM结构域与膜结合时，talin棒状结构域是否具有相同的张力机械敏感响应，作者使用双阱光镊装置来拉拽膜结合的全长talin。该试验需要两个微球：一个微球用含PIP₂的脂质覆盖，另一个微球通过DNA连接子以及生物素-中性蛋白的相互作用结合Tn2 (图5a)。力谱结果表明，多个Tn2分子通常在珠子之间形成系链(tethers)。作者假设，由于talin与膜结合时形成相分离导致拉拽时发生断裂事件，因此接下来使用了Tn2^ΔDD，在保留了全长Tn2的膜亲和性和机械敏感性的同时，消除了膜上潜在的聚类。Tn2^ΔDD的结果类似于单个蛋白质的力曲线模型，因此可以进行更彻底的量化。Tn2^ΔDD与膜相互作用的破裂力范围为1 ~ 60 pN，平均破裂力为28.72 pN (n = 104个破裂事件)(图5b)。这些结果表明，Tn2 与膜的相互作用可以承受talin棒状结构域展开范围内的机械应力。作者还观察到连续的展开/再折叠循环(图5c)。这表明，talin与细胞膜的相互作用强到足以承受折叠单独的talin棒状结构域所需的机械应力。因此，talin棒状结构域在全长膜结合蛋白中表现出类似的机械敏感行为。

图5 聚类增强了talin与细胞膜的连接

本研究表明，细胞膜上由talin介导的液液相分离可能是黏着斑形成的关键机制之一。talin与PIP₂的结合不仅激活了talin的功能，还促进了它在膜上的相分离，形成二维的生物分子凝聚体。这种相分离机制可能为黏着斑的动态组装和解离提供了物理基础，同时也解释了黏着斑在高机械应力条件下如何保持有序的分层结构。本文的实验提供了证据，证明脂质水平上的空间组织可能具有深入细胞质的结构效应。未来的研究可以进一步探讨这种机制在其他细胞功能中的应用，以及膜相分离如何调控其他膜相关的生物过程。

参考文献

ⁱ Winograd-Katz, S. E., Fässler, R., Geiger, B. & Legate, K. R. The integrin adhesome: from genes and proteins to human disease. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15, 273–288 (2014).

供稿 | 刘雨嫣

审稿 | 吴其乐

责编 | 囡囡

设计 / 排版 | 可洲 

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