2020年专家共识：中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床应用

不想错过啰嗦的推送？

戳上方蓝字“啰嗦探案”关注我们

并点击右上角“···”菜单，

选择“设为星标”

证据强度： 

Ａ 为强烈推荐； 

Ｂ 为推荐，但其他替代方案也可接受； 

Ｃ 为推荐强度低，寻求替代方案；

Ｄ 为从不推荐。 

证据质量： 

Ⅰ 为证据来自随机对照试验， 

Ⅱ 为证据来自非随机对照试验， 

Ⅲ 为证据仅来自专家意见。

一、二代测序的临床需求与应用范围

1、概述

▶推荐意见1：

若怀疑细菌、真菌、DNA病毒、寄生虫、不典型病原体感染且需进行二代测序检测时，建议采用DNA检测；

若怀疑RNA病毒感染时，则建议采用RNA检测（A，Ⅱ）。

▶推荐意见2：

对于临床疑似感染的病重、病危或免疫抑制、免疫缺陷患者，建议在完善传统实验室及分子生物学检测的同时，采集疑似感染部位的标本进行二代测序（B，Ⅱ）。

2、在临床疑似中枢神经系统感染中的适用范围

▶推荐意见3：

对于怀疑中枢神经系统急性感染的患者，如有条件，推荐在抽取脑脊液时同步留取2mL脑脊液标本保存于-16~-20℃冰箱。

在完成常规生物化学检查和培养之后，若3d内未获得明确的病原学依据且经验性抗感染治疗无效，推荐对留存的脑脊液标本进行二代测序检测。

若未留存标本，可重新采集标本（A，Ⅱ）。

▶推荐意见4：

对于疑似中枢神经系统病毒感染的患者，如有条件，推荐在抽取脑脊液时同步留取2mL脑脊液标本保存于-16~-20℃冰箱。

在传统PCR分子检测（包括多重探针分子PCR方法）后若未能获得明确的病原学依据，推荐对留存的脑脊液标本进行二代测序检测。

若未留存标本，可重新采集标本（A，Ⅱ）。

▶推荐意见5：

对于慢性中枢神经系统感染及需要随访病原学证据的患者，可首选二代测序进行检测（A，Ⅱ）。

3、在临床疑似血流感染中的适用范围

▶推荐意见6：

对于怀疑血流感染的患者，如有条件，推荐在抽取血培养标本时同步留取2mL血标本，分离血浆后保存于-16~-20℃冰箱。

血培养3d未报阳且经验性抗感染治疗无效时，推荐对留存血标本进行二代测序检测。

若未留存标本，可重新采集标本（A，Ⅱ）。

▶推荐意见7：

对于怀疑继发性血流感染的患者，在原发感染灶的病原学检测为阴性或因各种因素无法送检合适标本的情况下，可考虑将血标本的二代测序检测作为二线检测方法（B，Ⅲ）。

4、在临床疑似局灶性感染中的适用范围

▶推荐意见8：

对于怀疑局灶性感染的患者，在对局灶部位完成常规的生物化学、培养或PCR检测后，若未能获取病原学诊断结果，推荐将二代测序作为二线首选检测手段（B，Ⅱ）。

5、在临床疑似呼吸道感染中的适用范围

▶推荐意见9：

对于呼吸道感染患者，若3d内未通过传统实验室检查获得明确的病原学依据且经验性抗感染治疗无效，推荐留取呼吸道标本进行二代测序检测（A，Ⅱ）。

▶推荐意见10：

对于高度怀疑病毒性肺炎且病情持续进展的患者，可先完善呼吸道病毒多重PCR检测，若为阴性，再行二代测序检测，并应同时进行核酸RNA反转录（A，Ⅱ）。

注意：

目前，二代测序成本仍较高，商业化的二代测序检测产品基于成本的考虑，其相对固定的数据覆盖度（如20M特异性序列）对不同类型呼吸道临床样本的灵敏度低于荧光PCR等传统分子检测方法。

因此，其不能替代传统检测方法（除非加大测序覆盖度使其灵敏度大于传统分子检测方法），而是应作为传统方法无法明确感染病原体时的补充。

二、二代测序的流程与质量控制

▶推荐意见11：

采集样本送检二代测序必须严格遵守无菌原则（A，Ⅱ）。

▶推荐意见12：

样本应直接从患者感染部位的体液或组织中进行采集（A，Ⅱ）。

▶推荐意见13：

当患者存在感染表现但病情危重或不能耐受有创操作时，可考虑采集患者的血液标本送检（B，Ⅱ）。

注意：

采集的样本应尽量选取感染部位的体液或组织，可提高检测结果的可信度。

若感染部位的样本采集难度较大，可选择外周血液标本，但有可能会降低检测结果的准确性。

目前有研究发现，对于重症肺部感染患者，痰液/肺泡灌洗液和血液标本检测病原体的一致性仅仅为40%~50%。

▶推荐意见14：

实验室在充分保障生物安全性的前提下，应建立完整的核酸检测流程（样本采集，样本前处理/核酸抽提及文库建立，质量控制及生物信息分析，二代测序结果的实验室判读）（A，Ⅲ）。

▶推荐意见15：

每批次实验中都应包括内参照、阴性对照品和阳性对照品。

每批次实验均需严格评估是否存在操作或环境带来的污染。

单个样本测序数据量特异性序列片段数建议不低于2×10^7条（即20M特异性序列数），此外建议测序序列读长不少于单端50bp（A，Ⅲ）。

▶推荐意见16：

对数据进行分析时，建议采用临床应用级别的数据库，审慎使用公共数据库（A，Ⅲ）。

▶推荐意见17：

建议二代测序检测病原体的报告应涵盖该批次实验中的内参照、阴性对照品和阳性对照品结果，并记录相关质量控制标准，如单个样本数据量、序列读长，以及相关的质控参数（A，Ⅲ）。

三、二代测序结果的临床应用建议及其临床判读、验证

▶推荐意见18：

二代测序结果应在与患者临床表现及实验室检查密切结合的前提下进行解读和验证（B，Ⅲ）。

▶推荐意见19：

对于疑似中枢神经系统、血流、呼吸道感染或需排除感染性疾病的患者，根据推荐意见1至13采集合适的样本进行二代测序，根据送检样本类型结合患者的临床表现及其他结果辅助判断或排除诊断，同时应注意排除检出病原体定植的情况（B，Ⅱ）。

▶推荐意见20：

对于二代测序结果为阴性，但根据其他辅助检查结果（如培养结果）高度提示感染可能的尚不能排除感染的患者，建议必要时再次取样重复二代测序检测（B，Ⅱ）。

四、二代测序在临床感染性疾病中针对不同病原体类型的诊断效能

▶推荐意见21：

在中枢神经系统感染中，目前证据提示二代测序检测细菌、寄生虫、病毒的效果较好，而中枢神经系统真菌感染仍需更大样本量的临床试验来检验其检测效能（B，Ⅱ）。

注意：

“由于二代测序在中枢神经系统感染中的应用仍以病例报道为主，所以可参考的大型研究较少。脑脊液通常含有较低的病原体量，故病原体检测更具挑战性。”

“国外一项研究显示，与传统临床实验室检查结果比较，二代测序的灵敏度为73％，特异度为99％，阳性预测值为81％，阴性预测值为99％。”

“另一项研究发现在疑似中枢神经系统感染的初治患者中，与培养相比，二代测序具有90％的灵敏度，其检出率较培养提高了约25％。”

 ▶推荐意见22：

对于脓毒症患者，推荐联合采用传统实验室培养和二代测序来提高病原学的检出率（B，Ⅱ）。

注意：

“一项中国的研究显示，以培养为金标准，二代测序的灵敏度和特异度分别为72.7％ 和89.6％”，

“若以培养联合二代测序、桑格法测序验证作为金标准，则二代测序的阳性率较单用血培养有显著提升（23.08%比12.82%）。

另一项关于脓毒症休克的研究中，二代测序的阳性率在起病前3周内波动于71％左右，而血培养阳性率仅在起病时达33%，此后波动于10%~20%。”

▶推荐意见23：

对于局灶脓肿或组织感染患者，二代测序的总体灵敏性和特异性均较好，其中对细菌检测的灵敏性优于真菌（A，Ⅱ）。

▶推荐意见24：

对于呼吸道感染，二代测序在病毒及少见病原体的检测中体现出较好的检测效能；但在细菌、真菌等病原体的检测中，二代测序尚不能准确判断菌群定植或感染状态，仍需依赖临床医师结合患者病情进行进一步分析（A，Ⅱ）。

注意：

“一项中国的研究对561例患者（其中呼吸道感染255例）的各种标本行二代测序检测（其中肺泡灌洗液＋痰标本共292份）；

结果提示与培养相比，二代测序对结核分枝杆菌、厌氧菌、真菌的检出率均显著高于培养；

以临床诊断为金标准，二代测序比培养显著提高了灵敏度（50.7%比35.2%），而特异度无显著区别。”

▶推荐意见25：

对于结核分枝杆菌、伤寒沙门菌、布鲁菌等胞内菌，以及具有细胞壁的真菌，二代测序的检测效能会相对降低，应对上述菌群设置特定的序列数阈值（A，Ⅲ）。

▶推荐意见26：

对于新发、罕见、疑难感染性疾病，以及免疫缺陷患者，二代测序能显著提高病原体的检出率，可作为上述疾病的一线检测手段（A，Ⅲ）

五、二代测序在成本经济效益分析下的临床应用推荐

▶推荐意见27：

目前，开展二代测序的成本仍较高，尚不能作为轻症感染性疾病的一线检测手段（A，Ⅲ）。

相关阅读：