提高对脓毒症免疫血栓发生机制和干预策略的认识
提高对脓毒症免疫血栓发生机制和干预策略的认识
脓毒症是由于感染引起机体宿主反应失调，最终导致多脏器功能障碍的临床综合征，是当今ICU患者的主要死亡原因之一。据统计，2017年全球脓毒症患者病死率已达到22.5%，约占全球总死亡患者的五分之一。脓毒症发病机制复杂，主要涉及过度炎症反应、免疫功能紊乱、凝血功能障碍等，多系统功能失调相互影响、相互促进，通过网络状效应加剧脓毒症的恶性发展。免疫应答与凝血系统相互作用失调时，易导致多级血管中形成微小的免疫血栓（immunothrombosis），是诱发弥散性血管内凝血（DIC）和多器官衰竭的主要原因。临床资料显示，30%~50%的脓毒症患者会发生DIC，其病死率高达28%~43%。因此，免疫血栓发病本质和干预途径问题日益受到关注与重视，已成为脓毒症研究的重要领域之一。
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1 免疫血栓发生机制
德国学者Engelmann和Massberg在2013年提出了免疫血栓的概念，即在（微）血管内由天然免疫反应引起的血栓。感染后，病原体分子模式（PAMP）和损伤相关分子模式（DAMP）直接激活单核-巨噬细胞、中性粒细胞与血小板等，与凝血因子相互作用形成免疫血栓。当局部感染时，免疫血栓具有限制、捕捉和杀灭病原体的作用，以防止病原微生物进一步播散。但当严重的全身性感染或脓毒症时，免疫血栓可发生于不同层级静脉、动脉和微血管，形成广泛的血管内凝血，将直接引起DIC和多器官损伤。
1.1 单核细胞
机体感染后，PAMP和DAMP等通过模式识别受体（PRR）活化单核细胞，继而激活天然免疫反应。研究发现，活化的单核细胞表面表达组织因子（TF），并通过释放微粒（MP）将TF运送到血液循环中，激活外源性凝血途径。在重症新型冠状病毒肺炎（以下简称新冠）患者外周血中发现，表达TF的中性粒细胞（CD14+TF+）比例显著增加，并且与血小板形成复合物，二者相互活化参与免疫血栓形成。除直接参与激活凝血途径之外，单核-巨噬细胞还通过焦亡途径释放大量炎性细胞因子和DAMP，主要包括白细胞介素（IL）-1β和IL-18等，由此激活中性粒细胞。
1.2 中性粒细胞
中性粒细胞在免疫血栓形成过程中发挥关键作用。感染状态下活化的中性粒细胞产生大量活性氧类（ROS）、发生钙超载，经由多条信号通路共同诱导细胞发生胞外诱捕网样凋亡（NETosis）。例如，肽酰精氨酸脱亚氨酶（PAD4）触发染色质解离、髓过氧化物酶（MPO）和粒细胞弹性蛋白酶（NE）转位入核、炎性小体介导细胞膜穿孔等；最终向胞外释放游离DNA（cfDNA）形成骨架，搭载多种细胞内蛋白成分，包括瓜氨酸化组蛋白（cisHis）、MPO、NE和PAD4等共同组成的网状结构，即中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）。NETs为血小板和红细胞吸附及纤维蛋白聚集提供了"脚手架"；同时，NETs包含复杂的蛋白成分，不仅可以通过XII或TF分别激活内源性或外源性凝血途径，还能通过血管性血友病因子（vWf）和组蛋白直接吸附活化血小板，共同促进血栓结构形成。此外，MPO和NE通过氧化还原作用灭活抗凝血因子阻断抗凝血效应，如抗凝血酶（AT）、组织因子途径抑制剂（TFPI）和血栓调节因子（TM）。
1.3 血小板
血小板是微血栓结构的核心组分，其黏附与活化直接参与构成免疫血栓。研究表明，与其他免疫细胞相同，血小板表面也表达Toll样受体（TLR）。感染后TLR介导活化的血小板通过多条途径参与调控凝血过程。首先，活化的血小板表面表达多种受体与免疫细胞结合产生相互作用，如P-选择素、血小板糖蛋白Ibα（GPIbα）等。P-选择素与中性粒细胞表面P-选择素糖蛋白配体-1（PSGL-1）促进中性粒细胞向感染部位募集；GPIbα进而与中性粒细胞表面Mac-1结合，稳定细胞间相互作用并激活NETosis。其次，活化的血小板释放大量多磷酸盐（polyP）影响凝血途径，包括诱导凝血因子XII激活、加速因子V活化、促进纤维蛋白聚集、抑制纤维蛋白溶解等。
1.4 补体
补体是天然免疫反应中重要组分，炎症反应时补体系统与凝血途径密切相关。补体途径的终末产物膜攻击复合物（C5b~9）可插入细胞膜，使磷脂酰丝氨酸（PS）外翻，诱导内皮细胞产生TF、血小板表达P-选择素。在未形成补体复合体前，C5a同样具有促凝血功能。研究发现，C5a能直接上调内皮细胞表达TF，参与调控肥大细胞表达纤溶酶原激活抑制剂（PAI-1），抑制纤维蛋白原溶解。
2 免疫血栓监测指标
目前，临床上常用的凝血指标包括血小板计数、凝血酶原时间（PT）、D二聚体、纤维蛋白原等，均可反映体内凝血状态，用于诊断脓毒症DIC。但这些指标均以凝血途径为参照，不能特异性反映免疫血栓的形成状态与过程，而免疫血栓的监测需要综合考虑免疫系统与凝血系统的相互作用。如前所述，单核细胞、中性粒细胞等参与调控免疫血栓形成的主要免疫细胞，其功能和组分是监测免疫血栓的金标准。
2.1 微粒和组织因子
TF是激活外源性凝血途径的关键因子。活化的单核细胞表面表达TF，还可以通过胞吐方式产生MP，将TF释放到外周循环中，激活更广泛的凝血反应。日本学者Matsumoto等通过流式分析的方法检测了外周血中单核细胞来源TF表达微粒（CD13+TF+MPs），发现脓毒症患者外周血中CD13+TF+MPs数目明显增多，与APACH Ⅱ评分和DIC评分显著相关。有研究评估了中性粒细胞来源MP（NDMP）在预测脓毒症预后中的临床意义，结果同样显示NDMP与脓毒症严重程度和病死率呈正相关。
MP的大小不等，其内容物和表面成分依据细胞来源和外界刺激而异。脓毒症状态下，MP显著影响炎症反应和凝血途径，检测表达TF的MP含量更特异的反映免疫细胞参与凝血过程。目前，尚缺乏标准的临床检验方法对MP进行分离和定量检测。实验室主要通过标记细胞表面特异性抗原明确MP的细胞来源，通过Annexin-V结合表面PS，再利用流式细胞仪分析MP含量，但Annexin-V标记MP的特异性和敏感性均较低。因此，MP结构和功能的深入研究可能为发现特异性标志物提供理论支持，对监测脓毒症免疫血栓形成、预测DIC等具有重要临床价值。
2.2 NETs成分
NETs在免疫血栓形成过程中占据核心地位，诸多资料证实外周血NETs组分水平与脓毒症DIC及不良预后紧密相关。NETs的主要成分是其骨架结构cfDNA。早在2006年就发现ICU患者外周血中cfDNA水平高于健康对照组，其中并发脓毒症或者死亡组cfDNA显著升高。另据报道，当cfDNA水平≥2.35 ng/μL时，其预测ICU病死率的敏感性和特异性分别为88%和94% 。实际上cfDNA并不完全等同于NETs，细胞发生焦亡、凋亡时均可释放cfDNA，但并非所有cfDNA都参与NETs形成。因此，cfDNA是否可以反映免疫血栓的形成状态有待验证。有学者在脓毒症患者中动态观察反映中性粒细胞NETosis的多个指标，包括流式分析DNA损伤的中性粒细胞、外周血核小体、DNA-MPO复合体等，发现脓毒症合并DIC患者中上述指标均显著高于未发生DIC患者。诸多资料提示，脓毒症时中性粒细胞NETs形成增加，并且与DIC及不良预后紧密相关。由此可见，NETs主要成分和复合物均可作为监测免疫血栓的有效标志物，期待未来开发出更便捷的检验方法，通过临床试验明确有预测价值的临界值。
3 免疫血栓的干预对策
3.1 NETs干预
NETs干预以降解已生成的NETs和阻断NETs形成两方面为靶点。cfDNA骨架结构是NETs形成的基础，降解cfDNA是较为行之有效的治疗策略。脱氧核糖核酸酶Ⅰ（DNase Ⅰ）是体内产生的一类可以消化单链或双链DNA的核酸内切酶。在动物实验中观察到，脓毒症时外周血中cfDNA浓度持续升高，而DNaseⅠ活性变化明显滞后。脓毒症患者体内DNaseⅠ水平则一直处于较低水平。因此，外源性补充DNaseⅠ可能有助于NETs的降解。Pulmozyme（Dornase alfa）是目前用于临床治疗肺囊性纤维化的重组人DNaseI制剂，通过吸入途径靶向溶解肺泡液中DNA成分。在近年来的新冠肺炎治疗中表现出较好疗效，吸入Dornase alfa患者肺泡灌洗液中DNA-MPO复合物明显减少，氧合指数也有所改善。但脓毒症时微血管内广泛形成NETs，吸入给药方式存在一定局限性。在脓毒症小鼠模型中，静脉注射rhDNaseⅠ能够明显改善炎症反应状态，提高动物生存率。DNAseⅠ在体内半衰期较短，为进一步提高外源性rhDNaseⅠ在体内的活性，有学者尝试用纳米颗粒搭载rhDNaseⅠ以达到缓释之目的；与传统rhDNaseⅠ相比，它对脓毒症小鼠体内NETs的降解作用更加显著，并有助于减轻器官功能损伤。根据临床观察和动物实验资料，补充外源性rhDNaseⅠ可有效降解NETs，但在用于脓毒症治疗时，其治疗时间窗、治疗剂量、给药方式等诸多问题亟待解决。
中性粒细胞NE参与NETs形成，并嵌入NETs骨架结构影响凝血途径。此外，NE通过发挥其水解活性造成内皮细胞和组织器官损伤。NE抑制剂——西维来司他（Sivelestat）是全球首个治疗伴有全身炎症反应综合征的急性肺损伤药物。一项回顾性研究发现，经过Sivelestat治疗的脓毒症患者氧合指数较对照组无明显优势，但DIC评分逐日改善，ICU住院时间也明显缩短。另一项研究联合使用Sivelestat和重组人TM（rhTM）治疗，DIC评分和患者生存率改善相较于单独使用更加显著。
PAD4是中性粒细胞内触发NETosis、形成NETs的关键分子。动物实验证实，利用PAD4抑制剂明显减少外周血NETs的生成。但是目前PAD4的抑制剂众多，特异性和有效性存在差异，仍缺少足够证据明确其在脓毒症治疗中的有效性。
3.2 焦亡抑制剂
脓毒症时单核细胞内炎症小体切割活化Gasdermin D（GSDMD）蛋白，转位至膜上形成孔洞，最终导致细胞膜破裂，诱发细胞焦亡。发生NETosis时中性粒细胞中物质的释放也依赖于GMDMD孔洞。因此，阻断GMDMD是抑制单核细胞焦亡和NETs形成的又一潜在靶点。近年来研究发现，一种用于治疗酒精成瘾的药物——双硫仑可有效阻断GMDMD孔洞的形成，进而阻止IL-1β释放和焦亡的发生。脓毒症小鼠模型初步证实，正常剂量的双硫仑即能降低动物病死率。体外实验亦证实，双硫仑可以有效防止中性粒细胞NETs的形成。双硫仑在临床上已安全使用数十年，在动物体内外实验中均表现出显著的GMDMD抑制效应。虽然多项研究中所用剂量在FDA批准的标准剂量范围内，但脓毒症合并肝肾功能损伤时，双硫仑及其复杂的代谢产物是否会产生不良影响仍不清楚，目前用于临床治疗尚有很大的不确定性。
单核细胞焦亡产生过量IL-1β，进而活化中性粒细胞。抑制IL-1β虽不特异，但可以从根源上减少中性粒细胞的活化和NETs形成。阿那白滞素（Anakinra)，是重组人IL-1受体拮抗剂，目前被批准用于治疗类风湿性关节炎。早期开展了两项III期临床试验，均未能证实阿那白滞素对改善脓毒症患者预后有明确效果。有学者对试验数据重新分析，发现在脓毒症合并DIC的患者队列中，阿那白滞素治疗可以改善预后，降低病死率。随后的资料显示，治疗效果因患者血清中内源性IL-1受体拮抗剂浓度而异，在血清IL-1受体拮抗剂水平较高时阿那白滞素治疗能降低28 d病死率。由于疗效和机制尚不明了，至今未进一步开展阿那白滞素治疗脓毒症的大规模临床研究。
3.3 抗血小板制剂
临床广泛应用的抗血小板制剂包括氯吡格雷和阿司匹林，是既往患有冠心病和心肌梗死中老年人的日常用药。在脓毒症患者中开展了多项临床试验，大多数结果显示前期服用抗血小板治疗的患者，急性肺损伤发生率、住院时间、病死率等明显低于未用药患者。最近的资料表明，在老年人群体中，长期服用阿斯匹林并不能降低脓毒症的病死率。以上临床研究均以长期服用抗血小板制剂的脓毒症患者为调查对象，在脓毒症发生后给予抗血小板治疗是否有助于预防微血栓和DIC形成尚无定论。
3.4 补体抑制剂
依库珠单抗能与C5特异性结合，从而抑制其裂解为C5a和C5b，并防止产生C5b~9，是目前临床批准上市的C5抑制剂，用于治疗阵发性血红蛋白尿症。C3抑制剂尚处于临床试验阶段，Cp40和AMY101是目前研究较多的两种化合物。补体抑制剂的适应证和研究范围较局限，新近有学者尝试在新冠肺炎患者中观察其治疗效果。结果发现，在接受AMY101或依库珠单抗治疗后，患者外周血炎症因子水平下降、NETs释放减少、呼吸功能改善。目前类似研究多为个案报道，样本数量有限，尚不足以证明补体抑制剂在改善脓毒症免疫血栓中的有效性。
4 问题与展望
免疫血栓实质上是免疫系统和凝血系统交互作用的产物，与广义血栓的主要区别在于，免疫血栓更加强调天然免疫反应在血栓形成中的意义，重点关注机体感染后由免疫系统激活而诱发的凝血功能障碍。中性粒细胞NETs形成在免疫血栓的病理生理过程中占据主导地位，也是临床监测和干预的潜在靶点。
值得注意的是，免疫血栓形成是一个动态变化过程，从早期中性粒细胞活化、到NETs形成、血小板黏附，各阶段均有多种免疫细胞和凝血因子相互作用、相互影响，同时也存在可逆性调控机制。因此，对免疫血栓的监测不可"管中窥豹"，联合多种指标进行动态监测，才能从多个维度更加精准地反映机体状态，为进一步干预治疗提供参考依据。
来源：张卉 吴瑶 姚咏明.中华急诊医学杂志, 2023,32(2) : 137-141.
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