临床分离沙门菌血清型、药物敏感性和毒力基因的研究
浙江省临床分离沙门菌血清型、药物敏感性和毒力基因的研究
沙门菌属细菌是肠杆菌科中人兽共患的革兰阴性病原菌，主要通过污染食品和水源后经口感染，引起人类和动物的沙门菌感染疾病，其临床表现为胃肠炎、食物中毒、菌血症、伤寒和副伤寒等。我国细菌性食物中毒有70%～80%由沙门菌引起，其中鼠伤寒沙门菌、猪霍乱沙门菌、肠炎沙门菌等血清型主要通过污染动物性食品引起人类食物中毒，严重影响公众健康[1]；全球范围每年约有9 400万例患者感染沙门菌，约155 000例死于急性感染，其中85%归于动物性食品污染[2]。近年来，抗菌药物的不合理使用甚至滥用加剧了沙门菌的耐药情况，目前存在不同程度的耐1种或多种抗菌药物的现象，特别是对耐氟喹诺酮类(首选药)的耐药情况，给临床治疗带来巨大挑战[3]。监测数据表明，沙门菌多重耐药率已从20世纪90年代的20%左右增至21世纪初的70%[4]。沙门菌的致病性与其毒力因子相关，沙门菌致病涉及由不同基因编码的多种毒力因子，包括毒力岛基因(hilA、ssrB、marT、siiD、sopB、pagN、vexA)、毒力质粒基因(icmF、spvB)、菌毛操纵子毒力基因(pefA)和细胞膨胀毒素(cdtB)等。这些毒力因子有助于沙门菌在复杂的环境内完成侵袭、繁殖、发挥毒力和传播[5]。多种毒力基因均参与表达，毒力基因携带率越高表明沙门菌的潜在致病性越强[6]。本研究对2010年至2017年浙江省9个地区的临床分离沙门菌进行分析，明确其血清型分布、抗菌药物耐药性和毒力基因分布情况，为今后制订预防措施及指导临床合理用药提供科学依据。
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材料与方法
一、菌株来源
本研究为回顾性分析，收集2010年至2017年浙江省杭州市、台州市三门县、宁波市北仑区、嘉兴市、衢州市、舟山市、绍兴市、湖州市、玉环市9个地区临床分离的463株沙门菌(剔除同一患者的重复株)。所有菌株来源均通过浙江大学医学院附属第一医院科研伦理委员会审核批准(2019-1329)。
二、主要试剂与仪器
SS琼脂干粉、肉汤培养基、半固体琼脂均购自杭州滨和微生物试剂有限公司，哥伦比亚血平板购自法国生物梅里埃公司；Vitek 2 Compact微生物鉴定仪及配套鉴定板条购自法国生物梅里埃公司；沙门菌属血清诊断试剂盒购自日本生研株式会社；氨苄西林、哌拉西林/他唑巴坦、氨苄西林/舒巴坦、环丙沙星、氨曲南、氯霉素、头孢噻肟、甲氧苄啶/磺胺甲
三、细菌鉴定、血清分型和药物敏感试验
待测细菌采用Vitek 2 Compact微生物鉴定仪鉴定到属。按沙门菌属血清诊断试剂盒操作说明书对待测菌株进行O和H抗原检测，与Kauffmann-White抗原表对比确定沙门菌属的血清型。按照美国临床和实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)2017年抗微生物药物敏感试验执行标准中推荐的K-B纸片扩散法，进行手工药物敏感试验，在恒温[(35±2) ℃]培养箱中孵育18～24 h，而后测量抑菌环的直径，并按照其标准判断结果；以大肠埃希菌ATCC 25922作为质控菌株进行质量控制。
四、毒力基因的测定
采用热裂解法提取菌株基因组DNA。以PCR法检测菌株的11种毒力基因，见表1，引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反应体系为25 μL，包括RR045A扩增反应液12.5 μL，正、反向引物(10 μmol/L)各1.0 μL，模板DNA 2.0 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃保存备用。扩增产物经15 g/L琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察结果。
五、测序验证
各毒力基因PCR扩增产物中选取1株阳性产物送上海生工生物工程有限公司进行基因测序，测序结果经美国国家生物技术信息中心/局部序列排比检索基本工具(National Center for Biotechnology Information/basic local alignment search tool，NCBI/BLAST)比对确认。
结 果
一、一般资料
463株沙门菌分别分离自粪便(409株)、血液(44株)、尿液(3株)、引流液(3株)、骨髓(2株)、脓液(1株)和关节液(1株)。463例患者中，男256例，女207例，男女比为1.24∶1；年龄范围为3个月至86岁，见表2，以儿童患者(0～<7岁)感染占比最高，进一步对237例儿童患者细分，婴儿期(0～<4个月)9例(3.80%)，小儿期(4个月至≤2.5岁)176例(74.26%)，幼儿期(>2.5岁～<7.0岁)52例(21.94%)，故以小儿患者感染沙门菌占比最高。全年均有检出，5月份至10月份检出率为88.98%(412/463)，为沙门菌感染的高峰期。
二、血清分型结果
463株沙门菌共检出35种血清型，其中鼠伤寒沙门菌194株(41.90%)，肠炎沙门菌103株(22.25%)，伦敦沙门菌19株(4.10%)，纽波特沙门菌和婴儿沙门菌各16株(3.46%)，德比沙门菌15株(3.24%)，甲型副伤寒沙门菌和斯坦利沙门菌各11株(2.38%)，其余27种血清型共78株(16.85%)。
三、体外药物敏感试验结果
见表3。463株沙门菌中，对氨苄西林的耐药率(66.52%)最高，其次为氨苄西林/舒巴坦(46.87%)；对哌拉西林/他唑巴坦的耐药率(3.24%)较低；无亚胺培南和美罗培南耐药株。非耐药菌株共118株(25.49%)，对单一抗菌药物耐药的菌株81株(17.49%)，多重耐药(3类及以上抗菌药物耐药)菌株188株(40.60%)，其中99株(21.38%)对4～6种抗菌药物耐药；4株(0.86%)对7种抗菌药物耐药。
四、毒力基因的检测结果
经PCR及测序验证，11种毒力基因在沙门菌种的分布如下：毒力基因hilA、ssrB、marT、siiD、sopB、pagN在所有沙门菌株中都存在；毒力基因vexA只在伤寒沙门菌和都柏林沙门菌中检出；毒力基因icmF主要存在于肠炎沙门菌中，在肠炎沙门菌中阳性率为88.07%(96/109)；毒力质粒基因spvB和pefA表现为成对出现，且主要分布于猪霍乱沙门菌(4株中均有)、肠炎沙门菌[89.32%(92/103)]和鼠伤寒沙门菌[19.59%(38/194)]中；毒力基因cdtB则主要分布于伤寒沙门菌(3株中均有)和甲型副伤寒沙门菌(11株中均有)中。
讨 论
通常情况下，沙门菌易感染10岁以下儿童，尤其是婴幼儿，老人和免疫力受损者也易感。研究提示我国近几年婴幼儿细菌性腹泻的病原菌主要为沙门菌[7]。在本研究中，浙江省临床沙门菌感染以0～<7岁的儿童为主，这可能因为儿童免疫功能尚未成熟，免疫力较为低下，且喜欢通过吮、舔、摸等动作来认识外界，尚未形成良好的卫生习惯，导致感染沙门菌后病情重而快速就诊；其次为18～45岁的青年，可能与此年龄阶段人群在外活动及就餐机会较多有关。从时间分布来看，各季度均有沙门菌检出，但以5月份至10月份居多，这与云南省田云屏等[8]、广东省何冬梅等[9]、深圳市林爱红等[10]的研究结果一致，提示高温季节为感染沙门菌的高发季节，应注意食品卫生和加强沙门菌的检测。463株沙门菌优势血清型为鼠伤寒沙门菌，其次为肠炎沙门菌。这与田云屏等[8]报道的云南省近年来流行的主要血清型为肠炎沙门菌略有不符；而与何冬梅等[9]和林爱红等[10]报道的广东省、深圳市以鼠伤寒沙门菌最多，肠炎沙门菌其次的结果较一致。总体而言，肠炎沙门菌及鼠伤寒沙门菌一直是国际和国内检出的主要沙门菌血清型，临床上应格外关注这2种沙门菌。
近年来，在养殖业中以预防、治疗疾病和促进畜禽生长为目的的抗菌药物的滥用，以及临床上可治疗沙门菌感染疾病的抗菌药物的广泛使用，加重了沙门菌的耐药性。常用于治疗沙门菌感染的头孢菌素类、喹诺酮类和广谱青霉素类等耐药率均较高。本研究中，463株临床分离沙门菌对氨苄西林耐药率最高，达66.52%，提示氨苄西林已不宜作为沙门菌感染的经验性治疗用药。环丙沙星的耐药率为9.29%，虽然不算很高，但其中介率达51.40%。环丙沙星作为一线抗菌药物，在临床中的滥用和不合理治疗使细菌对氟喹诺酮类抗菌药物的耐药率不断上升。有报道环丙沙星的耐药率高达36%时，治疗沙门菌病可能会导致失败[11]。因此，若环丙沙星耐药率持续增高，环丙沙星是否适合作为沙门菌感染的经验用药，值得商榷。本研究中沙门菌对临床常用的第3代头孢菌素类如头孢噻肟和头孢他啶的敏感率分别为83.59%和76.03%，对第4代头孢菌素头孢吡肟的敏感率为84.88%。第3代头孢菌素类具有良好的药代动力学特点，毒副不良反应较小，对沙门菌的抗菌活性强，推荐作为临床经验用药的首选[12]。另外，本研究中受试沙门菌对亚胺培南、美罗培南全敏感，对哌拉西林/他唑巴坦的耐药率较低，可作为治疗有沙门菌感染适应证患者的备选药物。本研究显示463株沙门菌中共188株(40.60%)为多重耐药沙门菌，耐药情况严峻，提示加强沙门菌的耐药性监测与临床用药的科学性和严谨性，将对预防和控制沙门菌感染的发生，减少耐药菌的发生和发展起到重要作用。
沙门菌的致病性和耐药性与其毒力基因有很大关系。这些毒力基因除少数存在于质粒外，大多数都存在于染色体上，被称为沙门菌毒力岛(Salmonella pathogenicity islands，SPI)。研究表明，沙门菌的致病能力与SPI密切相关[13]。目前已发现二十几种SPI，不同血清型沙门菌携带SPI的种类不尽相同，与菌株致病力的差别有一定关系。本研究选取SPI-1至SPI-6代表性毒力基因hilA、ssrB、marT、siiD、sopB、pagN作为靶基因进行PCR扩增，所有菌株均为阳性，提示携带这些毒力基因的沙门菌具有较强的致病力，也提示可利用这些基因作为沙门菌感染临床标本快速初筛的特异性基因。毒力基因vexA为SPI-7上的代表基因，编码Vi抗原，在本研究中完全分布于伤寒沙门菌和都柏林沙门菌中。有关实验表明与Vi抗原阴性的伤寒沙门菌相比，Vi抗原阳性的伤寒沙门菌能与CO32-结合，降低细胞内信号通路中的蛋白激酶磷酸化，减少IL-8的产生，从而抑制炎症[14]。从某种程度上来说，Vi抗原还对人体有保护作用。目前已经研制出失活的Vi抗原疫苗，它是目前较为有效的人类预防伤寒的方法之一[14]。沙门菌质粒源的毒力基因于1982年被首次发现，它是沙门菌在网状内皮系统繁殖所必需的。质粒的其他一些基因座，如菌毛操纵子Pef，连接转移基因TraT，还有未知功能的Rck和Rsk操纵子，可能在感染阶段有重要作用，但并非所有沙门菌都具有毒性质粒[15]。沙门菌的毒力质粒基因spvB和pefA经常由同一质粒编码，因此在本研究结果中spvB和pefA为成对出现，且主要分布于猪霍乱沙门菌、肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌中。伤寒毒素细胞致死膨胀毒素(cytolethal distending toxin，CDT)基因cdtB主要分布于伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌中，与之前Skyberg等[16]的报道有较好的一致性。伤寒沙门菌毒素在人体内的作用方式独特，它可使宿主真核细胞在2～5 d内缓慢死亡，研究认为这与伤寒沙门菌的慢性感染密切相关[14]。
综上所述，本研究明确了浙江省9个地区临床分离沙门菌的血清型分布、耐药状况和毒力基因分布情况：鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌为分离菌种中的优势血清型，菌株出现对氟喹诺酮耐药和多重耐药情况严重，携带多种毒力基因，且毒力基因分布和血清型有一定关系。故临床上在治疗沙门菌引起的感染时，要根据其菌种类型和药物敏感试验结果选择合理的抗菌药物，以减少耐药菌株特别是多重耐药菌株的出现。
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引用: 王月, 陈晓, 王若南, 等. 浙江省临床分离沙门菌血清型、药物敏感性和毒力基因的研究 [J] . 中华传染病杂志,2020,38 (10): 646-650.