外泌体在细菌感染性疾病中的作用机制
碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌感染的紧迫现状及实验室诊断（PPT课件）
细菌感染对人类健康构成重大威胁，在2019年，约1 370万人死于感染相关性疾病，其中约有770万人死于细菌相关性感染，因金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌等5种主要致病菌死亡的人数占死亡总数的54.9%[1]。据统计，金黄色葡萄球菌是135个国家发生感染的常见病原菌，也是导致15岁以上患者死亡的常见致病菌；而在5岁以下儿童中，肺炎链球菌是导致死亡最常见的病原菌[2]。近年来，外泌体在治疗组织炎症、器官损伤、细胞移植等方面取得了极大的进展[3,4]。外泌体通过独特的生物学特性参与疾病的发生发展过程，调节机体的免疫反应，因此也被视为治疗感染性疾病的潜在候选方法之一，现重点综述外泌体在细菌感染性疾病中的调控机制，为临床医生提供新的诊疗思路。
1 外泌体生物学特性
1.1 外泌体的发现：
1983年，Harding等[5]在绵羊网织红细胞中首次发现外泌体；Johnstone等[6]在1987年首次提出"外泌体"（exosomes）这一新名词，由此揭开了外泌体神秘的面纱。
1.2 外泌体的来源、组成及功能：
外泌体是细胞外囊泡的一个子集，直径约40~160 nm[7]。在人体内几乎所有的细胞都可分泌或释放外泌体，其广泛存在于机体内组织液中，如尿液[8]、精液[9]、肺泡灌洗液[10]、唾液[11]等。外泌体中存在丰富的遗传物质（DNA、RNA）、蛋白质、脂质等生物活性分子，主要包括mRNA、微小RNA（microRNA，miRNA）以及一些非编码RNA（noncodingRNA，ncRNA）、DNA等。以miRNA为例，外泌体对调控细胞周期、细胞分化、生长发育等起着十分重要的作用，同时在细胞间信息交流中也发挥着重大作用[12]。外泌体蛋白质主要包括热休克蛋白（heat shock proteins，HSP70、HSP90）、四聚体蛋白（CD63、CD81、CD82）等，常参与膜的融合和蛋白质的转运以及鉴定等功能[13]；此外，外泌体上的脂质，如磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、胆固醇、花生四烯酸等，常用于保护外泌体，特别是在转运过程中保护其不被降解和稀释[14]。
1.3 外泌体的分离与鉴定：
现常利用细胞上清液和体液提取、分离外泌体，主要包括超速离心法（ultracentrifugation，UC）、尺寸排阻色谱法、蔗糖梯度离心法、商用试剂盒等。UC被誉为分离外泌体的"金标准"，目前已有成熟商业试剂盒（如ExoQuickTM）。外泌体的鉴定主要通过其大小、形态和表面特异性蛋白来确认，方法主要包括形态鉴定（电子显微镜）、粒度测量（直径分析）和标记蛋白检测（蛋白质印迹）等，其中透射电镜是鉴定外泌体大小、形状的"金标准"[15]。
1.4 外泌体的存储：
外泌体能够在体液中稳定广泛存在，-70 ℃是外泌体保持生物活性的最佳储存温度[16]，-80 ℃较适合长期储存，外泌体的保存可能受外泌体来源物质的影响较大，目前尚无统一的保存方法[17]。
2 细菌感染性疾病的发生机制
细菌感染性疾病是由细菌入侵机体引起感染的一种疾病，细菌感染可导致局部炎症（如肺炎），甚至脓毒症等。众所周知，细菌的毒性分为侵袭力和细菌毒素，而构成侵袭力的影响因素主要包括细菌的酶、荚膜及其他表面结构物质；细菌毒素分为外毒素和内毒素两大类。细菌造成感染并在体内长期定植的原因主要为宿主的免疫抑制、宿主免疫力低下、致病菌发生免疫逃避、抗菌药物的无效杀伤等[18,19]。
⑤铜绿假单胞菌：通过外泌体使外泌体外毒素A（exotoxin A，ExoA）与ADAM10特异性结合，调节细胞膜的通透性和细胞屏障的完整性；此外，铜绿假单胞菌衍生的外泌体具有免疫调节作用，通过诱导调节性T细胞（regulatory T cell，Treg），抑制辅助性T细胞2（helper T cell 2，Th2）反应。
3 外泌体调控不同病原菌感染作用机制的研究
3.1 金黄色葡萄球菌：
金黄色葡萄球菌是一种人畜共患病原体，也是医院获得性感染的常见原因，常引起皮肤软组织感染、骨关节感染（化脓性骨髓炎）、感染性心内膜炎，甚至会造成菌血症、多器官功能障碍等，其中主要的致病机制离不开毒力因子（毒素、酶类、某些蛋白等）的作用，使机体产生免疫逃避、细菌黏附、营养获取等现象[20]。外泌体常作为细胞间信息交流的工具，通过将外泌体运输或者传递给宿主细胞，从而影响其生物学反应，例如，金黄色葡萄球菌中的葡萄球菌毒素（包括超抗原和成孔毒素）是重要的毒力因子。利用细菌DNA和DNA甲基化诱导分泌带有ADAM10 [21]的外泌体充当结合多种毒素的清除剂，通过细胞间信号转导，使其与α-毒素结合，从而对宿主细胞起到保护作用；利用lncRNA在金黄色葡萄球菌-外泌体中的差异表达，筛选出lnc-AFTR，使其与Fas细胞表面死亡受体（Fas cell surface death receptor，FAS）mRNA直接结合，阻止翻译过程，主要通过抑制TNF信号通路和MAPK信号通路发挥抗炎、抗凋亡作用，达到治疗急性乳腺炎的目的[22]。通过外泌体进行细胞间药物递送，如利用巨噬细胞产生的外泌体可将抗菌药物利奈唑胺（exosomal formulation of linezolid，ExoLZD）输送到受体细胞中，最后发挥杀菌作用[23]；还可通过MExoV、MExoL根除细胞内MRSA[24]。在未来，外泌体有望成为给药载体的新型制剂。早在2015年，有研究者发现外泌体可以作为胰腺癌的诊断标志物[25]；之后，有研究者在感染金黄色葡萄球菌的牛奶源外泌体的全基因组miRNA分析中发现，miR-223和miR-142-5p是检测早期乳腺炎的潜在靶标[26]。
3.2 大肠杆菌：
大肠杆菌是一种适应性强、致病性广、可以共生的革兰阴性兼厌氧杆菌，其常造成各种感染的发生，如引起腹泻常被描述为肠道致病性大肠杆菌，引起肠道外感染则被称为肠道外致病性大肠杆菌。在感染大肠杆菌小鼠尿液的外泌体中发现了丰富的乳铁蛋白，因此，利用外泌体独特的生物学特性发挥杀菌作用，如通过外泌体-外源性乳铁蛋白减少了尿道致病性大肠杆菌（uropathogenic Escherichia coli，UPEC）在膀胱上皮细胞的黏附，对机体应对UPEC产生保护作用[27]。目前，相关研究证实外泌体在炎症调节中的作用，其通过调节巨噬细胞极化进行，在UPEC中也不例外，利用睾丸来源的外泌体传递miR-155-5p，促进睾丸巨噬细胞激活并释放炎症因子，进一步加重UPEC诱导的睾丸炎[28]。此外，利用外泌体参与免疫调节和宿主对病原体感染的免疫反应[29]。例如：利用外泌体调控宿主-黏附侵袭性大肠杆菌（adherent-invasive Escherichia coli，AIEC）的相互作用，激活先天免疫反应[30]。对于产志贺毒素的大肠杆菌来说，志贺毒素是造成溶血性尿毒症综合征和中枢神经系统损害的主要毒力因素，经过实验将志贺毒素与外泌体联系起来，通过外泌体进行细胞间转导，以神经酰胺三己糖（globotriaosylceramide，Gb3）方式将毒素转运至人近端小管上皮细胞株HK-2的内质网，释放促炎因子，诱发炎症反应[31]。在大肠杆菌的分型中存在一种AIEC，据报道，AIEC与炎症性肠病的发病存在相关性[32]。在AIEC感染期间，通过外泌体进行细胞间交流，可将遗传物质（如mRNA、miRNA）从供体细胞转移到受体细胞，使受体细胞的功能发生变化。研究者发现，从AIEC感染的肠上皮细胞释放的外泌体，通过外泌体将miR-30c和miR-130a转移到受体细胞以抑制自噬相关蛋白ATG5和ATG16L1的表达，抑制自噬介导的细胞内AIEC的清除[33]。此外，AIEC也可以影响新生儿，造成肠道菌群失调，有研究者发现，人乳低聚糖利用外泌体作为载体，实现从母体到新生儿的运输，从而免受AIEC感染，帮助新生儿重塑肠道黏膜免疫力[34]。
3.3 肺炎链球菌：
肺炎链球菌是呼吸道常见病原菌，常导致肺炎和脑膜炎等疾病发生，一般通过黏附-定植-毒力过程完成；其中肺炎链球菌的毒力作用离不开荚膜、质膜、细胞壁、毒力蛋白等[35]。目前关于肺炎链球菌与外泌体的研究甚少，研究显示，外泌体在感染肺炎链球菌期间发挥着抗原呈递作用，通过小鼠树突状细胞衍生出外泌体，并在其表面发现一种新型抗原，通过抗原呈递作用，使其与肺炎链球菌发生交叉反应，该抗原还可诱导小鼠对肺炎球菌感染产生免疫防御作用[36]。
3.4 肺炎克雷伯菌：
肺炎克雷伯菌属于革兰阴性杆菌，常导致上呼吸道和消化道感染，目前对外泌体与肺炎克雷伯菌的研究较少，Kovach等[37]研究发现，促炎剂IL-36γ由肺巨噬细胞以微粒和外泌体的形式分泌，通过细胞间信号转导，介导TLR/MyD88途径，释放炎症细胞因子如TNF-α、IL-1β等，加重肺炎克雷伯菌感染，造成广泛的组织损伤。因此，临床上可以通过研制IL-36γ抑制剂来达到治疗目的。
3.5 铜绿假单胞菌：
铜绿假单胞菌是一种常见革兰阴性菌，其致病性离不开毒力因子的作用，如细菌毒素（外毒素）、脂多糖、鞭毛、外膜蛋白等。研究显示，ADAM参与许多疾病的发生发展，特别是ADAM10和ADAM17，可以调节病原体入侵、毒力因子、细胞因子释放、白细胞募集等；实验证明通过外泌体使ExoA与ADAM10特异性结合，使其介导Trans蛋白降解，调节细胞膜的通透性和细胞屏障的完整性[38]；还可以通过外泌体使ExoA与ADAM17特异性结合，防止屏障破坏和增加入侵病原体的清除，达到治疗效果[39]。铜绿假单胞菌常导致肺部损伤，如肺炎、过敏性哮喘等。现可以利用外泌体治疗铜绿假单胞菌造成的肺部损伤，例如，自然杀伤细胞通过分泌外泌体促进肺巨噬细胞向M1极化，发挥抗炎效果，从而改善铜绿假单胞菌诱导的肺损伤[40]。Ding等[41]发现，铜绿假单胞菌衍生的外泌体具有免疫调节作用，通过诱导Treg细胞，抑制Th2反应，从而抑制气道高反应性、抑制肺组织支气管周围和血管周围炎症的发生以及血清IgE水平，减轻哮喘严重程度。
4 外泌体调控细菌感染性疾病的临床应用
利用外泌体本身独特的生物学特性，外泌体可以作为一种药物递送工具或一种疾病的治疗制剂，还可以作为疾病的新型诊断标志物。外泌体可以参与细胞凋亡、血管生成、免疫调节、肿瘤迁移等多种病理生理过程。在病理条件下，外泌体可以通过细胞间信息的传递[33]、抗原呈递[36]、介导免疫反应[41]，通过调控各种信号转导通路发挥作用，如TLR/MyD88信号通路[37]，还可以通过miRNA发挥作用，如外泌体通过促进miRNA从一个细胞转移到靶细胞成为细胞间通讯的重要使者[33]。外泌体通过调控自噬发挥抗感染效果，如在克罗恩病相关的黏附侵袭性大肠杆菌感染过程中，利用外泌体将miRNA从一个细胞传递给另一个细胞以抑制自噬发生，达到治疗目的[33]。最后还可以利用外泌体或细胞外囊泡在细胞与细胞之间或者细胞与宿主之间建立一个反馈环路。外泌体治疗感染性疾病的一般结果是：①使炎症减轻：炎症细胞因子和中性粒细胞浸润减少，促进巨噬细胞向M1极化[40]；②减少细胞凋亡[22]；③促进炎症反应：增加炎症因子（如IL-1β、TNF-α等[37]）释放，这些作用主要是通过外泌体释放一些物质，如某些蛋白、毒力因子等介导一系列反应完成的。
5 总结与展望
纵观学者们对外泌体与细菌性疾病的研究历程，自发现外泌体与细菌感染的关联性以来，此领域的研究不断深入，目前已经发现，外泌体将携带与细胞来源相关的核酸、蛋白质、脂质等传递给受体细胞，从而调节受体细胞功能，参与了感染性疾病发生发展的诸多过程。但现有的研究仍有不足之处：首先，外泌体分离纯化技术尚不完善，获取纯度高、数量多的外泌体难度较大；其次，目前对外泌体的研究多局限于动物模型、细胞实验，较少投入到临床试验中，未来仍需大量的研究进一步为临床应用提供依据；最后，外泌体对细菌性疾病的研究主要局限于常见病原菌，未来仍需在其他病原体中继续发现相关作用机制。随着分离技术和人们认知的提高，外泌体在感染性疾病中的作用将被进一步解释，引起内容物的细胞或组织的特异性，外泌体必将成为感染性疾病的良好靶点或载体。
引用: 刘诗斯, 张斌, 孙强. 外泌体在细菌感染性疾病中的作用机制研究进展 [J] . 中华危重病急救医学, 2023, 35(12) : 1327-1330.