结核性脑膜炎诊断新技术的现状与进展
结核性脑膜炎诊断新技术的现状与进展
结核性脑膜炎（tuberculous meningitis，TBM）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis， Mtb）感染引起的脑脊膜非化脓性炎性疾病，是结核病中最致命的肺外结核病型。尽管接受了抗结核治疗，TBM患者的病死率仍超过30%［1］。在合并人类免疫缺陷病毒（HIV）感染的TBM患者中病死率接近40%，而合并HIV感染的耐药TBM患者病死率可高达100%［2］。TBM患者能否得到早期的诊断和及时的治疗是影响预后的关键因素［3］。但TBM的临床表现多样且缺乏特异性，难以通过临床表现和脑脊液常规、生化等参数与其他病原菌引起的脑膜炎进行鉴别［4, 5］。此外，TBM患者脑脊液中Mtb的载量通常较低，这对TBM的病原学诊断提出了极大的挑战［6, 7］。因此，在临床上应用和普及快速有效、特异性强、敏感度高的Mtb及其耐药性检测方法，对TBM诊疗效率的提高至关重要［8］。在传统的病原学检测方法中，抗酸染色廉价、快速、简单易实施，但敏感度欠佳，无法检出低菌载量样本中的病原体［9, 10］；尽管后来提出的改良抗酸染色能够使细胞内外的Mtb同时在镜下呈现，增加了对脑脊液样本中Mtb的检出率，但通过染色镜检无法区别Mtb与非结核分枝杆菌，且无法提供病原菌的耐药信息［10, 11, 12］。脑脊液Mtb培养仍然是目前诊断TBM的“金标准”，但耗时至少2周，这限制了TBM的早期诊断［13, 14］。
我们以“结核性脑膜炎”“病原学诊断”“环介导等温扩增”“二代测序”“三代测序”“蛋白组学”“代谢组学”“Xpert Ultra”“tuberculous meningitis”“etiological diagnosis”“pathogenic diagnosis”“loop-mediated isothermal amplification”“LAMP”“second generation sequencing”“next generation sequencing”“third generation sequencing”“Proteomics”“Metabolomics”等作为中英文检索词，在中国知网、万方数据库、PubMed和Web of Science中检索了2018—2023年的相关文献，综述如下。
一、核酸检测方法
近年来，核酸测序技术的快速发展使对Mtb进行核酸层面的检测得以实现，通过对特异基因的测序和匹配来识别样本中Mtb的方法能够提高少菌脑脊液样本中Mtb的检出率，大幅缩短检测时间，提高TBM的早期诊断效率；而且核酸检测方法的检出效能受抗生素影响不大，对于在检测前有抗生素或抗结核药物治疗史的患者尤为适用［5，15, 16］。
（一）Xpert Ultra检测法
Xpert Ultra检测法在Xpert（即GeneXpert MTB/RIF）的基础上进行了改进，新增2个不同的扩增靶点（IS6110和IS1081），改用全巢式核酸扩增技术并使用更大的PCR管以提高检测敏感度［17］。此外，Xpert Ultra也沿用了Xpert MTB/RIF使用的rpoB基因靶点，可检出rpoB基因利福平（rifampicin）耐药决定区内的突变，因此能够同步完成对Mtb的快速检测及其利福平耐药性的确定，检测时间仅2 h，且检测全程在封闭的试剂盒中自动进行，减少了交叉污染的可能［18］。
Xpert Ultra的检出阈比Xpert MTB/RIF低7倍，更适用于对少菌样本中Mtb的检测［17］，2017年WHO推荐将Xpert Ultra用于肺外结核的初始测试［19］。近年来，Xpert Ultra在TBM诊断中的可靠性已得到多项临床研究的评估［20, 21, 22, 23, 24］；相关研究结果表明，Xpert Ultra诊断TBM的敏感度为60%~90%，特异度>90%；其敏感度显著高于Xpert MTB/RIF［22，25］。但目前该方法在我国的临床应用仍然十分有限［26, 27］，可能与价格昂贵、设备和技术条件要求高有关。
（二）环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术
LAMP技术通过使用Bst DNA 聚合酶对与Mtb相关的特异性靶点进行扩增，该聚合酶能够使核酸扩增在恒温的条件下进行，无需使用热循环器进行温度循环，随后通过肉眼观察液体的浑浊程度进行结果判断。
LAMP诊断TBM的综合敏感度为76%，综合特异度为99%［28］。2023年的一项研究结果显示，分别以sdaA、IS1081、IS6110三类片段为检测靶点的LAMP诊断TBM的敏感度均大于Xpert Ultra，分别为82.5%、87%、80.5%和67%，4种方法的特异度均为100%；并且对于Xpert Ultra能检出的样本，3种针对不同单一靶点的LAMP均能检出；若将sdaA、IS1081和IS6110 3个基因片段均作为LAMP的检测靶点，那么这种多靶点LAMP的敏感度可达88%，特异度为100%［29］。LAMP技术操作简单、成本低、耗时短（仅需1 h）且对实验设备要求不高，易于在基层医院开展。但相较于上述已经过大量大规模临床研究验证的Xpert MTB/RIF和Xpert Ultra，目前LAMP在临床实践中尚未得到普遍应用。
（三）mNGS技术
mNGS技术通过使用数百万个随机引物对样本中所有的遗传物质进行高通量测序，随后过滤掉背景微生物、低质量、短读长、低复杂性序列以及宿主核酸，再将剩余的核酸序列与微生物基因组数据库进行匹配，理论上可以识别样本中所有微生物［7，30］。其检测时间为24~48 h。
mNGS的主要优点和临床价值在于其广谱病原检测能力，即无需假设诊断便能够检出样本中所有潜在的病原体。将mNGS用在疑似TBM患者脑脊液样本的检测中，有助于临床上快速识别真正的致病菌，并提示可能的合并感染，进而为后续的诊治提供可参考的信息和依据［3，12，31, 32, 33］。目前mNGS在临床上已广泛用于TBM的辅助诊断，在确诊TBM患者中其敏感度范围为65%~100%［5，12, 13，15，34, 35］；在确诊、很可能、可能TBM中，其敏感度范围为7%~85%，特异度>75%［5，12, 13，15，33，36, 37, 38］。mNGS诊断TBM的敏感度高于Xpert MTB/RIF，两种方法的特异度基本相当［12, 13］。
但在另一方面，mNGS无偏倚、高灵敏的检测特点也使污染物、定植菌等病原体极易被检出，产生假阳性结果，干扰临床判断并引起额外的检查，甚至引起不必要的治疗［7，39, 40］。因此，对于mNGS报告的混合感染和意料之外的致病微生物，通常建议进一步使用对应的传统病原学检测方法进行验证［41］。此外，在脑脊液样本中mNGS报告出的Mtb复合群特异性序列数非常低，多为个位数［3，5，32，34，39，42］。这可能是由脑脊液中Mtb含量少、Mtb壁厚且脂质含量高、DNA提取困难、样本中核酸降解等因素综合导致的［7，32］。2020年来自西京医院的一项研究通过对脑脊液样本离心处理后取上清液进行检测，减少了细胞沉淀中的宿主核酸对mNGS结果的干扰，进而显著提升了mNGS对Mtb的敏感度和检出的特异性序列数［32］。另外，尽管理论上mNGS能够为Mtb耐药性检测提供核酸序列信息，但在临床应用中由于特定微生物序列数占比少，特异性序列覆盖度低，其对Mtb耐药基因的检测较为受限［31］。
近年来开展的多项研究表明，mNGS、Xpert MTB/RIF、抗酸染色和BACTEC MGIT 960液体培养等方法检出的阳性结果之间都有未重叠区域，因此各方法间无法互相替代，提示联合使用多种方法可提高脑脊液中Mtb的检出率［5，12, 13，34］。
（四）靶向二代测序（targeted next-generation sequencing，tNGS）技术
tNGS结合了靶向PCR扩增技术和高通量测序技术，只对选定的核酸区域进行扩增和测序，可以避免人类基因和背景菌等不相关核酸对检测的干扰［43］。此外，由于无需对样本中所有的核酸进行检测，tNGS的检测成本得到大幅降低，检测时间也更短，耗时约24 h［44］。但由于tNGS的测序不涉及除靶点外的其他核酸，因而无法检出未知病原体，tNGS的使用依赖于临床医生对致病微生物的预判［45］。
2019年发布的Deeplex Myc-TB便是基于tNGS的Mtb检测技术，通过不断地优化，目前Deeplex Myc-TB可对18个Mtb复合群耐药基因进行靶向测序，能够同时鉴定分枝杆菌的种类、基因分型及其对利福平、异烟肼、乙胺丁醇、链霉素、利奈唑胺、阿米卡星、卡那霉素等多种抗结核药物的耐药性［46］。
2023年7月WHO发布的1篇关于将tNGS用于检测耐药结核病的通讯中表示，tNGS在Mtb耐药检测上具有效率高、效能好的显著优势［47］。截至目前，tNGS在TBM诊断中的效能尚未得到评估和报道。但已有研究报道了tNGS在中枢神经系统感染中的检测效能，其结果显示tNGS敏感度为81.8%，高于脑脊液培养和涂片（13.6%）；但tNGS特异度低于脑脊液培养和涂片，分别为76.9%和100%［48］。此外，另一篇病例报告显示了tNGS对Mtb的高检出性能，对于1例痰、支气管肺泡灌洗液病原学检测以及肺组织mNGS检测结果均为阴性的患者，tNGS能够在其肺组织中检测出Mtb；根据tNGS的检出结果，患者被明确诊断为由Mtb引起的继发性组织相关性肺炎，并且在接受抗结核治疗后症状明显好转［49］。
（五）三代测序（长读长测序）
三代测序技术无需对核酸分子进行剪切和扩增，能够直接对单个DNA或RNA分子进行测序，相较于二代测序技术，它能够对更长的核酸序列进行测序，因此又称为“长读长测序”。三代测序技术的长读长特点意味着它对大量长重复区域的分析较读长有限的二代测序更加精准，因为在二代测序过程中会先将样本中的核酸序列切割为小片段再进行扩增和测序，随后再进行拼接［30］，核酸序列的重复区域占比越高，其拼接错误、组装不全的可能性越大。因此，在技术原理上，三代测序更适用于测定具有高鸟嘌呤-胞嘧啶含量和高重复性特征的Mtb核酸序列。目前三代测序主要包括以下2种平台。
1.单分子实时测序（single molecule real time sequencing，SMRT）平台：
SMRT平台由PacBio（Pacific Biosciences）公司开发，通过探测DNA聚合酶与每个核苷酸结合时发射的荧光信号进行测序，目前该技术运用于Mtb的研究多聚焦在对Mtb基因组甲基化位点的检测［50, 51, 52, 53, 54］。SMRT技术揭示了Mtb甲基化的系谱特异性［51，54］以及Mtb耐药菌株的甲基化特征［52, 53］。研究发现，耐药Mtb的甲基化谱与转录水平、氮代谢通路、蛋白质-蛋白质相互作用等密切相关［52］。
2.牛津纳米孔测序技术（Oxford nanopore technologies，ONT）：
ONT的主要原理是通过检测核酸分子通过纳米级孔蛋白结构时周围的电流变化进行测序。ONT公司推出的ONT MinION测序平台仅1个U盘大小，便携且易运行。近年来，许多研究基于ONT技术开发了新的Mtb耐药检测流程和方法，包括低菌负荷标本快速耐药分析流程、表型耐药鉴定测序流程等［55, 56, 57, 58, 59, 60］。对这些流程的可靠性分析显示，尽管ONT技术的错误率较高，但对Mtb核酸分子的检测覆盖范围足以支持其用于耐药基因的快速检测［61］。部分流程经校准后的耐药检测结果与二代测序结果基本一致［55，60，62］，敏感度为94.8%，特异度为98.0%，且相较于二代测序，ONT检测耗时更短，效率更高［55, 56］。
总体而言，基于三代测序技术的发展，极为便携的测序设备和不断优化的耐药检测流程被开发；长读长测序也使得对Mtb及其耐药基因分析的精确度进一步提升，加深了人们在分子生物学层次对病原菌耐药机制的认识。但目前三代测序技术多局限于实验室研究，在临床中的应用很少。
二、组学
（一）代谢组学
通过核磁共振波谱法或质谱技术，结合气相或液相色谱分离法可对样本中所有的代谢物进行定量分析。既往的研究已发现多种氨基酸、有机酸、核苷酸和碳水化合物等物质具有TBM潜在诊断价值［63, 64, 65, 66］。但仅凭借上述代谢物的变化情况并不足以诊断TBM，近年来一些研究对TBM的免疫代谢网络和代谢机制等进行了探究，并发现部分代谢标志物与患者炎性反应及预后高度相关。研究发现，TBM患者脑脊液色氨酸水平与TBM患者60 d病死率相关，风险比为1.16，并且色氨酸水平与脑脊液中干扰素浓度呈负相关［67］。此外，通过将脑脊液代谢组学与细胞因子谱相结合，有研究者发现多种代谢物（如犬尿氨酸、乳酸、肉碱、色氨酸等）与TBM患者炎性反应密切相关［68］。
（二）蛋白组学
近年来，相关研究通过蛋白组学技术对与TBM相关的蛋白质种类进行了分析。通过同位素标记相对和绝对定量技术（isobaric tags for relative and absolute quantitation）发现，脑脊液中ApoB和NELL2两种蛋白有潜力作为TBM诊断的生物标志物。其中ApoB敏感度为89.3%，特异度为92%［69］；NELL2敏感度为83.3%，特异度为75%［70］。此外，相关研究通过液相色谱串联质谱法鉴定出了细菌性脑膜炎的潜在生物标志物——LCN2，LCN2可用于区分细菌性脑膜炎与包括TBM在内的其他中枢神经系统感染性疾病，其敏感度为88%，特异度为91%；通过将LCN2的水平与传统脑脊液参数（白细胞、蛋白质、葡萄糖、乳酸）相结合，可将检测敏感度从86%提升至91%，特异度可从92%提升至97% ［71］。
三、总结与展望
在TBM的病原学诊断中，传统检测方法如抗酸染色和培养存在敏感度不高、耗时长等不足，而Xpert MTB/RIF的出现不仅大幅提高了TBM的检出率，也极大地缩短了检测时长，提升了检测效率；Xpert Ultra则对Xpert MTB/RIF进行了改良，提高了对低菌载量样本的检测能力，更适用于Mtb含量较少的脑脊液样本；LAMP则具有低成本、低设备要求的优势，适合在基层医院使用。但上述检测方法都只能针对Mtb进行检测，mNGS则不仅能够检出样本中的Mtb，还能够同时鉴定样本中存在的其他病原体，因此在鉴别TBM和其他不明病原菌引起的脑膜炎中具有显著优势。但mNGS价格昂贵且易受来自环境或者试剂中的微生物序列污染，结果判读困难，因此不能作为唯一的检测手段。tNGS则聚焦于对样本中已知病原微生物及其毒力和耐药基因进行检测，其病原谱范围明确且检测成本较低，目前在临床中备受关注。三代测序技术目前多局限于实验室研究，其单分子、长度长的测序特点十分适合用于对Mtb的检测，加上小巧便携的设计，将来或许更易于被普及和推广。此外，代谢组学及蛋白组学等新技术的发展也为TBM的诊断提供了许多有诊断和鉴别价值的生物标志物。
总之，以上检测方法在TBM早期诊断中的应用各有优劣，目前没有任何一项检测方法可以完全取代其他方法，因此多种方法的联合检测可能更有利于提高TBM的检出率，为TBM的诊治提供依据。在未来，已有的检测技术仍有待被优化，更快速有效的检测方法也有望被开发。
引用：李一澄, 王婷, 黄温勉, 等. 结核性脑膜炎诊断新技术的现状与进展[J]. 中华神经科杂志, 2024, 57(3): 302-308.