【LorMe周刊】Rolf 团队研究之铁载体介导的微生物生态与进化
作者：顾少华，南京农业大学博士在读，主要研究铁载体介导的微生物互作与根际健康。
周刊主要展示LorMe团队成员优秀周报，每周定期为您奉上学术盛宴！本期周刊为您介绍走在研究铁载体前沿的团队——苏黎世大学植物与微生物生物学系进化生态学科的Rolf团队。
导读
Rolf Kümmerli 是苏黎世大学植物与微生物生物学系进化生态学科的带头人，目前Rolf研究团队有项目助理1人，博士后3人，在读博士5人，在读硕士3人，客座研究员1人。Rolf团队专注于微生物生态学和进化学的研究，他非常感兴趣的一个科学问题就是个体与个体之间合作的生态学机制是什么。他认为这个生态学问题是一个需要用进化的思维去分析的问题，因为合作行为很容易被不支付合作成本但仍受益于其他人合作行为的作弊者所破坏。在他的研究小组中，他们正在研究阻止微生物公共物质合作演变的因素，特别专注于细菌群落中分泌的公共物质铁载体。接下来，我们将为您介绍Rolf团队关于铁载体在介导微生物生态进化中的主要研究成果。
一直以来关于种群粘度(限制细胞离散)是否有利于合作都存在广泛的理论争论。限制离散增加了亲缘物种之间发生互动的可能性，这种互动有利于合作，但也会导致亲缘物种之间竞争的增加，从而减少或完全否定合作的选择。这些问题虽然在理论上备受关注，但缺乏实证研究。Rolf团队在不同琼脂添加量的培养基中培养病原铜绿假单胞菌，考察了产合作特性物质铁载体类群的生态位结果。
图1 琼脂浓度对细胞扩散性、铁载体扩散性以及突变株在群落中的相对适应度的影响
研究发现，生长培养基粘度的增加显著限制了细菌的离散和铁载体分子的扩散，同时相对于不产铁载体的突变体而言显著提高了产铁载体类群的生态位。该研究指出粘度高的情况有利于铁载体生产菌株生长，因为产生的铁载体扩散性小更有可能被亲属获得。与此同时，生产菌株分泌的铁载体不易扩散更有利于自身的吸收利用(即特征变得不那么合作)。此时Rolf团队发现微生物生长环境的黏度是决定自然栖息地野生型细菌和铁载体生产缺陷型突变体在群落中动态变化的关键因素。
图2 生境结构（数值越大表示结构越复杂）对铁载体扩散性和水溶性的影响
回到自然群落，Rolf团队开始思考细菌通常依靠分泌代谢物从环境中获取资源，这些代谢物可能在群落中共享。然而，代谢产物的扩散共享进化过程却难以解释，因为代谢物质可能会丢失或者被它人利用。自然选择是否可以作用于分子结构，以控制损失和共享性。Rolf 团队通过整理189种分泌铁载体的细菌资料，分析细菌分泌铁载体的扩散性以及栖息环境，验证了这种可能性。根据进化理论，Rolf 团队发现高度可扩散的铁载体优先生活在有结构栖息地的物种中进化（如土壤）。与此同时，生活在非结构性栖息地（如海水）的物种中，可扩散能力差的铁载体优先进化，结果表明这些代谢物质的可分享性较低，更有可能为生产者提供直接利益。Rolf团队揭示了微生物在合作进化过程中，无论如何进化，有一个根本是不变的原则就是最大化的维护群体利益。
动物学研究强有力的证据表明，自然选择可以支持表型可塑性，作为一种最大限度的生态位机制。Rolf团队开始思考研究铜绿假单胞菌中合作性状的铁载体(pyoverdin)生产的表型可塑性。对于单个菌株来说，生产Pyoverdin的代谢成本很高，但对局部群落而言却有好处，而且可能被不产生Pyoverdin的突变株（cheats）利用。Rolf团队将细菌置于铁可用性。
图3 不同铁素营养条件下不同细菌接种量以及不同时间假单胞菌铁载体的产生量，三角形表示50μM FeCl3，实心圆表示0.5μM FeCl3，空心圆表示0μM FeCl3.
不同的培养基中，观察其在社会环境中的变化，并测试细胞是否能够对这些变化做出相应的对pyoverdin生产的调节。研究发现，在细胞密度较高时，每个细胞的pyoverdin产量显著降低，而在存在作弊的情况下则有所增加。这种表型可塑性极大地影响了合作的成本和收益。具体来说，在富含铁的环境和细胞密度较高的条件下，对pyoverdin生产的资源投入减少，但在铁的限制下，以及当pyoverdin被骗子利用时，资源投入增加。研究表明，合作性状的表型可塑性是对环境变化的反应，即使是最简单的生物体，如细菌，也会发生这种变化。
从细菌到人类，自然界中存在着大量的公共产品用于合作交流。虽然以往的研究主要集中在有利于合作的行为和生态条件上，但公共物品本身的分子和调节特性是否会影响合作选择的问题却很少受到关注。Rolf团队使用人工复合种群模型展示了公共物品的延长分子耐久性——允许跨代多次利用——当（且仅当）公共物品的生产被授权管理时，可以极大地减少欺骗的选择。研究发现铁载体Pyoverdin是一种非常耐用的公共物品，这种延长的耐用性极大地增强了细菌的适应度。Rolf团队发现不产铁载体的突变体（欺骗者）在铁载体耐久性高的情况下，相对于生产者具有相对较弱的适应度。这是因为当环境中积累了足够的铁载体时，合作者就会临时减少他们在铁载体生产上的投资-这是一种成本节约策略，可以最大限度地降低其被欺骗者剥削。
在高等生物中，表型可塑性对竞争的反应是一种很好的现象。Rolf通过对铜绿假单胞菌的研究发现细菌也有能力感知竞争对手的存在，并根据当前的竞争水平对铁载体的表型进行微调。Rolf团队研究了铜绿假单胞菌(PA)和它的竞争对手Burkholderia cenocepacia (BC)之间的铁种间竞争，重点研究了PA对pyoverdine的表型调节能力。研究发现，在低铁可用性条件下，PA在竞争初期提高了pyoverdine产量，使PA以更早开始生长的形式占据了更多生态位。这种可塑性物质的提高是根据BC决定的竞争水平进行微调的。然而，在随后的时间点，与单一培养相比，共同培养的PA表现出较低的增长，这表明竞争反应是昂贵的。综上所述，铁载体表型可塑性在铁的种间竞争中起着重要作用。提高铁载体产量可能是应对铁竞争的一种有效策略，以此将铁从竞争物种中锁住，并将这种营养物质保留给具有可吸收的相容受体的菌株成员。
图4 不同铁素营养条件下PA和BC不同接种比例对铁载体产量以及PA生长状况随着接种时间的变化
在前面的研究中，Rolf团队发现微生物铁载体介导的竞争反应的代价是昂贵的，于是开始研究假单胞菌种群中合作成本对欺骗行为的选择规则。研究发现作弊行为很容易在限铁的环境中进化。这一发现可以用严格的铁限制来解释，铁限制要求铁载体的大量生产，这会导致合作伙伴产生高代谢成本，从而促进欺骗行为的传播。这些发现与这样一种观点是一致的，即作弊者不太可能入侵允许细菌减少铁载体生产的环境，因为这降低了合作伙伴累积的总代谢成本。Rolf团队在适度地增加铁的可用性和铁载体的循环利用机会时发现，自然界中生态条件的微小局部变化可以显著影响微生物对公共产品分泌的选择。此外，研究发现大多数突变株(84.6%)进化出的欺骗基因仅仅是在产生铁载体功能上存在部分缺陷，而不是整个铁载体循环功能的缺失。遗传方面的考虑表明，导致部分缺陷的突变比导致功能丧失的突变发生得更频繁，但也表明部分缺陷突变往往是更具竞争性的欺骗，因为减少了铁载体的代谢成本。
Rolf团队进一步研究了合作伙伴和骗子之间的共同进化动力学，并探究合作伙伴是否可以进化出策略来减少被剥削的负担，以及骗子是否可以反过来提高他们的剥削能力。Rolf团队首先进化出铜绿假单胞菌的合作者，可生产出共用的铁载体pyoverdine。同时进化出作弊者，虽然生产pyoverdine有缺陷，但吸收能力强。研究发现，在大约150代的实验进化中，合作者成功地与骗子共存得菌株占所有菌株的56%。生长与竞争分析显示，共同存在是由对介质的一般适应与对生产者与非生产者共同进化的特定适应相结合而形成的。表型筛选和
进化克隆的全基因组重测序证实了这一模式，并表明合作伙伴变得不那么容易被骗子利用，因为他们显著减少了对pyoverdine的投资。与此同时，骗子通过阻断昂贵的焦糖信号通路的突变，提高了利用效率。此外，进化后的合作者和欺骗者的运动性降低，这种模式可能代表了对实验室条件的适应，但同时也通过减少混合反应和铁载体共享影响了社会互动。总的来说，研究观察到合作者和骗子的共存是通过对非生物和社会环境的适应及其相互作用的结合而实现的。
图5 左图是进化后菌株相对于原始菌株铁载体产量以及合作适应度的相对值，右图是挑出来的克隆菌株相对原始菌株的适应度以及群游能力的相对值。
细菌通常拥有多个基于铁载体的铁吸收系统，用于从环境中获取铁素这种重要资源。然而，一些铁载体似乎是多余的，因为它们的铁结合效率有限，很少在铁的限制下表达。在这里，Rolf团队研究了为什么自然选择不能消除这种明显的冗余。研究材料依旧是铜绿假单胞菌，这种细菌可以产生两种铁载体，一种是高效但代谢昂贵的pyoverdine，另一种是低效但代谢廉价pyochelin。研究发现细菌具有调控产生铁载体分子机制，在严重限铁条件下调控主要产生pyoverdine，而在铁的适度限制下转变为主要产生pyochelin。进一步的研究证明，在中度铁限制条件下，只生产pyochelin的菌株比只生产pyoverdine的菌株生长得更好，而在重度铁限制条件下则相反。这表明pyochelin并不是多余的，但在不同铁载体策略之间的切换可能有利于提高铁载体利用效率和降低铁载体生产成本。实际上在波动的铁可用性下条件下，保持在两种不同铁载体之间切换功能可以显著增强菌株对环境的适应性。
图6关于假单胞菌土壤和池塘群落中铁载体PVD产量决定因素的主要结果综述。
Rolf团队研究发现铁载体介导的微生物生态进化是对非生物和社会环境的适应以及相互作用的结合而实现的。非生物因素和生物因素共同决定了细菌分泌铁载体的数量，以及铁载体是否可以被不生产的作弊者利用或被生产者用来抑制竞争对手。Rolf团队通过比较48个土壤和池塘群落中930株假单胞菌产铁载体的情况，探讨这些见解是否适用于自然群落。研究发现，pH值、铁含量、碳浓度和群落多样性决定了铁载体的产生水平，也决定了菌株被异(非自产)铁载体促进或抑制的程度。两种生境均出现了自身不产铁载体的菌落，但在土壤中更加普遍存在。环境和遗传分析表明，非生产者可以进化为骗子，利用异铁载体，但在铁可用性增加的环境中铁载体将有可能被停用。总的来说，研究发现土壤中比池塘中更能解释铁载体生产中菌株间变化的环境因素，可能是因为池塘中的高菌株混合度阻碍了当地的适应性。Rolf团队的研究揭示了自然细菌群落的复杂性，并首次揭示了以铁为基础的铁获取和环境假单胞菌竞争的多变量性质。
尽管合作者冒着被叛逃者剥削以及优势竞争者取代弱势竞争者的风险，但自然界中仍存在大量的合作与多样性。因此，了解合作和多样性的持续存在是进化生态学的一个重大问题，特别是在群落混合良好的情况下，在这样的情况下剥削和取代的可能性最大。在这里，Rolf团队证明了经济博弈论所描述的一种孤独者（不站队，不是剥削者也不是合作者，一种独立的存在，自给自足）的效应，可以在自然生物环境中保持合作和多样性。Rolf团队使用产生公物质的细菌的数学模型来表明，产生独立但相对低效的物品的独来独往菌株的存在会形成石头-剪刀-布的动力学，合作者超过独来独往者，欺骗者超过合作者，独来独往者超过欺骗者。这些模型预测得到了Rolf对混合良好的铜绿假单胞菌实验群落进化动力学观察的支持。研究发现，产铁载体pyoverdine的合作者和剥削利用铁载体的欺骗者的共存是由具有独立的铁载体机制的独来独往者所维持稳定的。Rolf的研究结果确立了孤独效应，它是环境中合作与多样性的一个简单而普遍的驱动力，否则，环境中就会出现背叛和多样性的侵蚀。
图7 两种菌群多样性的丧失和欺骗者的动态变化。在两种菌株的群落中，共存是不可能的，因为(a)合作者(深蓝色)取代了独往者(红色);(b) 独往者(红色)取代了欺骗者(白色);(c)欺骗者(白色)击败了合作者(深蓝色)。
所有的社会有机体都存在合作者与欺骗者，合作者往往又有利于群体其他成员，而欺骗者往往利用合作者进行自私的欺骗，这是所有社会有机体都会经历的困境。尽管细菌已经成为实验室研究系统社会困境的模型生物体，但我们对它们在自然社区中的相关性知之甚少。Rolf团队通过大量分离水体（149）和土体（148）环境中假单胞菌，并聚焦这些假单胞菌生长所需的单一可共享化合物铁载体（Pyoverdine）介导的社会互动（右图）来探究这样一个问题。研究发现，在自然群落中，存在着不产或者低产铁载体的微生物类群。虽然非生产着有针对多个铁载体受体的编码基因，并且能够利用来自其他社区成员的兼容的异源铁载体，但生长者可以通过分泌不同类型的铁载体来避免非生产者利用自己分泌的铁载体。这项研究表明，群落存在着对欺骗者和欺骗抗性的选择，这可能是导致自然生物群落的拮抗共进化和群落多样性形成的原因。
图8 最里面是系统是分离得到的假单胞菌的系统发育树，含有蓝、黄、灰色的那一圈表示的是分泌的铁载体功能类型，分别表示不产铁载体、产对群落有影响的铁载体和产对群落无影响的铁载体，最外圈柱状图是铁载体产量
Rolf团队主要将铁载体作为一个突破口去研究微生物生态与进化，但他的研究聚焦在假单胞菌，从未涉及根际微生物领域。而我们实验室的研究则放眼根际微生物群落，不仅仅局限于假单胞菌。同时我们可以将Rolf所提供的生态学和进化学层面的微生物互作模型和机理应用到根际生物防治土传病害的领域，通过铁载体了解根际微生物生态与进化，为维护根际健康，促进植物生长提供一个新的视角。目前我们实验室已经和Rolf团队取得合作，相信在双方的紧密合作下很快会取得实质性的研究进展。
参考文献
1 Kummerli,R., Griffin, A. S., West, S. A., Buckling, A. & Harrison, F. Viscous mediumpromotes cooperation in the pathogenic bacterium Pseudomonas aeruginosa. P Roy Soc B-Biol Sci 276, 3531-3538,doi:10.1098/rspb.2009.0861 (2009).
2 Kummerli,R., Jiricny, N., Clarke, L. S., West, S. A. & Griffin, A. S. Phenotypicplasticity of a cooperative behaviour in bacteria. J Evolution Biol 22,589-598, doi:10.1111/j.1420-9101.2008.01666.x (2009).
3 Kummerli,R. & Brown, S. P. Molecular and regulatory properties of a public goodshape the evolution of cooperation. PNatl Acad Sci USA 107,18921-18926, doi:10.1073/pnas.1011154107 (2010).
4 Kummerli,R., van den Berg, P., Griffin, A. S., West, S. A. & Gardner, A. Repressionof competition favours cooperation: experimental evidence from bacteria. J Evolution Biol 23, 699-706, doi:10.1111/j.1420-9101.2010.01936.x (2010).
5 Dumas,Z. & Kummerli, R. Cost of cooperation rules selection for cheats inbacterial metapopulations. J EvolutionBiol 25, 473-484,doi:10.1111/j.1420-9101.2011.02437.x (2012).
6 Dumas,Z., Ross-Gillespie, A. & Kummerli, R. Switching between apparentlyredundant iron-uptake mechanisms benefits bacteria in changeable environments. Proc Biol Sci 280, 20131055, doi:10.1098/rspb.2013.1055 (2013).
7 Kummerli,R. & Ross-Gillespie, A. Explaining the Sociobiology of Pyoverdin ProducingPseudomonas: A Comment on Zhang and Rainey (2013). Evolution; international journal of organic evolution 68, 3337-3343, doi:10.1111/evo.12311(2014).
8 Kummerli,R., Schiessl, K. T., Waldvogel, T., McNeill, K. & Ackermann, M. Habitatstructure and the evolution of diffusible siderophores in bacteria. Ecology Letters 17, 1536-1544, doi:10.1111/ele.12371 (2014).
9 Kummerli,R. et al. Co-evolutionary dynamicsbetween public good producers andcheats in the bacterium Pseudomonasaeruginosa. J Evolution Biol 28, 2264-2274, doi:10.1111/jeb.12751(2015).
10 Ross-Gillespie,A., Dumas, Z. & Kummerli, R. Evolutionary dynamics of interlinked publicgoods traits: an experimental study of siderophore production in Pseudomonasaeruginosa. J Evolution Biol 28, 29-39, doi:10.1111/jeb.12559(2015).
11 Granato,E. T., Harrison, F., Kummerli, R. & Ross-Gillespie, A. Do Bacterial"Virulence Factors" Always Increase Virulence? A Meta-Analysis ofPyoverdine Production in Pseudomonas aeruginosa As a Test Case. Front Microbiol 7, doi:ARTN 195210.3389/fmicb.2016.01952 (2016).
12 Inglis,R. F., Biernaskie, J. M., Gardner, A. & Kummerli, R. Presence of a lonerstrain maintains cooperation and diversity in well-mixed bacterial communities.Proc Biol Sci 283, doi:10.1098/rspb.2015.2682 (2016).
13 Butaite,E., Baumgartner, M., Wyder, S. & Kummerli, R. Siderophore cheating andcheating resistance shape competition for iron in soil and freshwaterPseudomonas communities. Naturecommunications 8, doi:ARTN 41410.1038/s41467-017-00509-4 (2017).
14 Weigert,M. et al. Manipulating virulence factoravailability can have complex consequences for infections. Evol Appl 10, 91-101,doi:10.1111/eva.12431 (2017).
15 Butaite,E., Kramer, J., Wyder, S. & Kummerli, R. Environmental determinants ofpyoverdine production, exploitation and competition in natural Pseudomonascommunities. Environmental microbiology20, 3629-3642,doi:10.1111/1462-2920.14355 (2018).
16 Leinweber,A., Weigert, M. & Kummerli, R. The bacterium Pseudomonas aeruginosa sensesand gradually responds to interspecific competition for iron. Evolution; international journal of organicevolution 72, 1515-1528,doi:10.1111/evo.13491 (2018).
【LorMe课堂】 重金属污染条件下产铁载体类微生物的生态选择【LorMe课堂】 东太平洋铁载体的前世今生【LorMe周刊】 探究根际的秘密——"世袭霸权"【LorMe周刊】 微生物铁载体与根际健康【LorMe周刊】 假单胞菌捕食者：探究噬菌体-宿主的相互作用【LorMe周刊】 捕食者与猎物的丰富度对生态系统功能有何影响？
南京农业大学-土壤微生物与生物有机肥料团队
微生态与根际健康实验室
Lab of rhizosphere Micro-ecology
立足国家需求，探索学科交叉，引领国际前沿
开展根际微生态研究、致力于根际健康调控、培养一流创新人才
竞争求发展，合作谋共赢。
Competition & Cooperation。
感谢您的关注和支持。