联合创始Editas的两位华人科学家将CRISPR带入点对点基因编辑时代，1.6万种遗传病或迎来治疗新选择丨医麦黑科技
今天是2017年10月27日
农历九月初八
医麦客：点对点打击致病基因突变
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视频来源 MIT Technology Review
CRISPR 技术
2017年10月27日/医麦客 eMedClub/--基因编辑作为近几年来生命科学领域最热门的话题之一，每一次技术的进步都会引起人们广泛的关注。目前，虽然基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术已经相对成熟，然而科学家在开发更好、更实用的基因编辑技术的路上却并没有停歇。
在短短三周的时间内，基因编辑领域再次迎来了三项突破性研究，分别在顶尖学术期刊《Science》和《Nature》上公开发表。而且这三项研究的两位负责人都是来自麻省剑桥Broad研究所的华人科学家，并且同属Editas Medicine公司的联合创始人。
REPAIR
CRISPR再添新工具
精准矫正致病遗传突变
其中两项研究是由张锋教授领导，作为近几年大热的CRISPR/Cas9技术的先驱开创者之一。张锋自2013年开发出了可用来编辑DNA、敲除指定基因的CRISPR/Cas系统之后就一直致力于推动这一技术走向完美，在改良及进一步改造CRISPR/Cas9这一工具的同时，张锋课题组也一直在为进一步扩大基因组编辑的工具箱而努力。
张锋(左)(图片来源 geekwire.com)
众所周知，CRISPR这一革命性技术在基因组DNA编辑方面发挥了许多重要的作用。虽然其主要应用于DNA，但一些新的研究已将它的范围扩展至RNA编辑。去年Nature Methods评选出的年度技术中就包括通过CRISPR基因编辑技术靶向RNA。而其中的一大进展就是张锋课题组关于能够靶向和降解RNA的一种RNA引导酶—Cas13a的研究。
Cas13(图片来源 Broad研究所)
在此研究基础上，2017年10月初，张峰研究团队于在Nature期刊上发表了名为“RNA targeting with CRISPR-Cas13”的文章。该研究证实了CRISPR-Cas13系统可以靶向哺乳动物细胞中的RNA。
Cas13a from L. wadei (LwaCas13a)is capable of eukaryotic transcript knockdown(图片来源 Nature)
在这项研究中，张峰和他的同事们证实了切割RNA的Cas13a酶能够特异性地降低哺乳动物细胞中的内源性RNA和报告RNA水平。此外，他们还构造出一种双质粒RNA靶向CRISPR系统，该系统在不同的质粒上表达向导RNA(gRNA)和Cas13a基因，其中Cas13a基因含有一种经过改造的核定位序列。(在人细胞系中，这种CRISPR/Cas13a构造物能够高效地切割报告质粒中转录的RNA和三种内源性基因转录的RNA。
2017年10月15日，仅仅时隔三周，又一篇力作“RNA editing with CRISPR-Cas13”发表于《Science》。在这项研究中，张锋团队证明了这种全新的CRISPR系统(REPAIR)能够有效地对RNA中的腺嘌呤(A)进行单碱基编辑。而由于 RNA 在人体中会自然降解，所以这一编辑的过程不会导致人类基因组的永久性改变，同时还有望精准地矫正会导致疾病的遗传突变。
矫正G-A突变(Broad研究所)
众所周知，DNA的双螺旋结构是由腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)四种碱基组成。A和T配对，C和G配对。而在人类遗传性疾病中，包括帕金森、局灶性癫痫、杜氏肌营养不良等在内的疾病患者，鸟嘌呤(G)到腺嘌呤(A)的突变极为常见。
那么如何从根源上治疗这些疾病，研究人员的第一反应当然是把A矫正回G，逆转这一突变。
腺嘌呤(A)在脱氨后转变为类似于鸟嘌呤(G)的肌苷(I)(图片来源 Nature)
而腺嘌呤(A)在脱氨后，会变成一种叫做肌苷(I)的分子，而它与鸟嘌呤(G)的结构非常相似，细胞甚至无法对这两者进行区分。其能够被RNA聚合酶识别，这就相当于把腺嘌呤(A)变成了鸟嘌呤(G)。实现了从A到G的精准矫正。
REPAIR系统(CRISPR/Cas13b)将腺嘌呤(A)转化为肌苷(I)(图片来源Science)
在10月初的《Nature》报道中，研究人员已经证实了Cas13不同于常见的Cas9，Cas13蛋白只靶向RNA，不会影响到基因组的遗传信息，从而进一步增加了基因编辑的安全性。在本次研究中，张锋团队通过对来自Prevotella细菌的Cas13b蛋白进行改造，使其失去“剪切”功能，并和一种叫做ADAR2的酶融合到一起。然后CRISPR/Cas13b系统能把ADAR2送到RNA上的某个特异位点，把腺嘌呤(A)转化为肌苷(I)。这套系统被命名为“REPAIR”(RNA Editing forProgrammable A to I Replacement)。
在后续的实验中，研究团队在人类细胞中引入了能导致范可尼贫血症(Fanconi anemia)和X连锁肾源性尿崩症(X-linked nephrogenicdiabetes insipidus)的致病突变，以检验REPAIR系统是否对其进行有效的修复。结果表明，在RNA的水平上，这些突变可以被有效的矫正，证明了该系统的可行性。
REPAIRv2系统可把全转录组中的可检测脱靶编辑数从18385降低到20(图片来源 Science)
之后，为了进一步提高了REPAIR的特异性，研究人员对其进行了一系列的修饰，使其成为REPAIRv2系统。结果表明，REPAIRv2系统可把全转录组中的可检测脱靶编辑数从18385降低到20！并且编辑RNA的效率最高可达51%。
ABE
无需使DNA断裂
即可完成基因的精准编辑
David Liu(中)(图片来源 Broad研究所)
另一项发表于《Nature》期刊上的重磅研究，同样是由来自Broad Institute的华人科学家所主导，系哈佛大学化学教授David Ruchien Liu。他领导的研究团队成功的将A-T碱基对转换为G-C碱基对，而这种调整或可解决已知的 16000 种与点突变相关的疾病。
32044种由点突变造成的人类基因变异(图片来源 Nature)
正常情况下，A和T配对，C和G配对。但C容易出现自发的脱氨突变，把原本的好好的C-G组合，变成A-T组合。这种DNA 长链中某一对碱基发生变异的现象被称为“点突变”。在已知的与疾病相关的 5 万种人类基因变异中，有32000种是由点突变造成的。因此，如果能通过定点修复这些基因突变，把A-T变回C-G，那么就有望从根本上纠正大多数人类遗传病。
在上文中，我们已经介绍了腺嘌呤(A)的脱氨反应，其在经过脱氨反应后生成的肌苷(I)与鸟嘌呤(G)的结构非常接近，能成功忽悠细胞里的DNA聚合酶。然后在经过简单的几轮DNA复制后，A-T组合就能变回C-G。不幸的是，迄今为止，科学家们还没有在自然界中发现能够在DNA中催化腺嘌呤(A)进行脱氨反应的酶。但是已经发现了一种能够催化转运RNA上的腺嘌呤(A)脱氨的TadA酶。
Liu教授研究团队认为，虽然TadA催化的对象是RNA，不是DNA，但他们认为TadA还是具有强大的应用潜力。基于此，该研究团队对TadA实施了改造，他们将编码TadA的基因引入大肠杆菌内，以筛选具有催化DNA中腺嘌呤(A)脱氨的突变体。
在这个过程中，研究人员引入了一套不切DNA的特殊的CRISPR/Cas9系统，用于精准定位，使其靶向特定的单碱基。在经过长达七轮改造优化之后，终于新的基因编辑工具诞生了！
ABE与CRISPR/Cas9编辑效率对比(左)异常插入和删除比率对比(右)(图片来源 Nature)
其被称为“碱基编辑器(ABE，adenine base editor)”，它能够重构单碱基 A 的结构，使其重组为 G，从而触发细胞对其他 DNA 链进行修复以完成整个转换过程。而最终的结果就是 A-T 碱基对被成功转换为 G-C 碱基对。这种技术的精妙之处就在于，它是将基因编码中的错误进行重写，而不是像传统编辑方法那样对 DNA 片段整体进行剪辑或切除。
碱基编辑器ABE—作用机理(图片来源Nature)
使用这种“碱基编辑器(ABE)”，研究人员在人体细胞内镰状细胞性贫血症（Sickle-Cell Anemia）和遗传性血色素沉着症进行的两项实验中，完全没有出现脱靶现象以及额外的 DNA 插入或缺失。
标准的基因编辑方法，比如 CRISPR/Cas9，可能会对 DNA 双链结构造成破坏。如果是为了插入或敲除某些 DNA 碱基，那么毫无疑问CRISPR/Cas9是非常有效的。 但如果目标仅仅是修复某个点的突变，“碱基编辑器ABE”只涉及碱基的重排，无需让DNA双链断裂，无疑是一种更为安全有效的方式。
此外，David Liu 教授表示，新的碱基编辑方法并不是要替代传统的 CRISPR技术，而是为治疗某些疾病提供了可选的方案。目前，David Liu和他的同事已经为“ABE(碱基编辑器)”申请了专利。
CRISPR、DNA碱基编辑、RNA碱基编辑技术对比(图片来源 Science）
另外一点值得一提的是，在CRISPR绊倒的地方，例如像神经元这一类不分裂的成熟细胞。REPAIR和ABE都有能力搏一搏，在一项未公开发表的研究中， Liu表示，他和他的团队已经表明，ABE可以编辑神经元中的基因，提高用ABE用于治疗破坏性神经疾病的可能性。
George Church(图片来源 STAT)
对此，George Church评价到，无论是REPAIR 或ABE或是接下来开发的基因组编辑工具，这都是一场改善CRISPR技术的激烈竞赛。有力的提醒我们，CRISPR距离人类精确的基因组编辑有多远。
同时，张锋教授和Liu也强调了，这两套基因编辑系统进入临床试验可能还需要几年时间，其是否具有优于现有基因治疗的优势还有待评估。然而，这些进展都在于是这CRISPR 2.0时代的到来！
本期医麦课堂，金鸣博士将主要就CRISPR高通量遗传筛选技术在生物医药领域的应用现状，分享一些自己的理解和感悟。也希望就此与大家进行讨论和交流。
▪ CRISPR高通量筛选的技术优势
▪ CRISPR高通量筛选的应用(进行药物筛选、寻找药物靶点、针对不同患者指导临床精准用药等)
▪ CRISPR高通量筛选技术为药企带来的技术革新
10月31日19：30，医麦客基因组编辑系列课程之“以基因组编辑为基础的高通量药物筛选:如何节约时间和成本”与你不见不散。
参考出处：
doi:10.1038/nature24644
DOI:10.1126/science.aaq0180
DOI:10.1038/nature24049
https://www.statnews.com/2017/10/25/crispr-gene-editing-advances/
https://www.technologyreview.com/s/609203/crispr-20-is-here-and-its-way-more-precise/
https://www.broadinstitute.org/news/researchers-engineer-crispr-edit-single-rna-letters-human-cells
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